王 楠，張 鏡

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

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慈橙皮果膠的提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究*

王 楠，張 鏡

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

慈橙皮；果膠；纖維素酶；抗氧化性

我國(guó)擁有豐富的柑橘資源，平遠(yuǎn)慈橙產(chǎn)于廣東梅州平遠(yuǎn)縣，是臍橙類的一個(gè)新品種。無(wú)論是在日常食用還是慈橙的食品深加工生產(chǎn)中，都會(huì)產(chǎn)生大量橙皮，它們并未得到最充分的利用，造成了資源的浪費(fèi)。而橙皮的利用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們想象。研究表明橙皮富含維生素C、黃酮類化合物、果膠等成分使之具有抗氧化[1]活性，從而具有抗癌防癌[2]、降低膽固醇[3]、減肥降脂[4]等功能。橙皮中含有大量有益天然化合物，果膠就是其中重要的一類。果膠獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)使其作為天然食品添加劑和保健品，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品和一些化妝品中，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前對(duì)慈橙果膠的研究不多見，本文采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，通過(guò)優(yōu)化纖維素酶法提取慈橙皮中果膠的最佳工藝條件，并進(jìn)一步將其離體抗氧化活性與維生素C進(jìn)行比較，為慈橙果膠資源的利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)材料：平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)社南黃沙村慈橙基地外皮色澤亮麗的新鮮慈橙。

試劑：纖維素酶 上海麗珠生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)Sigma公司；水楊酸、過(guò)氧化氫、七水合硫酸亞鐵等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：JJ2000電子分析天平，常熟市雙節(jié)測(cè)試儀器廠；T6新銳-可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-920A電熱恒溫干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海精科雷磁儀器有限公司；5805DM865782高速離心機(jī)，德國(guó)；ZN-200A高速粉碎機(jī)，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；HH.S11-4電熱恒溫水浴鍋，北京辰安科學(xué)儀器廠。

1.2 方 法

1.2.1 果膠提取工藝流程

新鮮慈橙→剝皮清洗→煮沸(滅果膠酶)→干燥粉碎→纖維素酶解→ 滅酶→離心→沉淀→提純→干燥→稱重。

1.2.2 果膠提取工藝要點(diǎn)

(1)將慈橙皮切成均勻小塊后，放入沸水中煮沸5 min，主要將橙皮中的果膠酶滅活，防止果膠降解。然后將橙皮浸泡沖洗，直至洗液為白色，除去部分可溶糖、色素等雜質(zhì)。

(2)電熱恒溫干燥箱調(diào)至60 ℃將慈橙皮烘干后粉碎。

(3)準(zhǔn)確稱取橙皮粉3.50 g，加入料液比1:(5～20)(g/mL)的醋酸-醋酸鈉緩沖液。pH在4.0～6.0之間，濃度在0.2%～0.5%之間的纖維素酶溶液，在40～60 ℃下酶解6 h。

(4)酶解后的溶液水浴加熱至90 ℃左右，恒溫放置10 min，使纖維素酶失活。

(5)離心，取上清液。濾渣用一定量的蒸餾水沖洗1～2次，合并上清液。并加入2倍體積的無(wú)水乙醇溶液沉淀過(guò)夜。

(6)將離心機(jī)速度調(diào)到5000 r/min，離心5 min。分離沉淀出的果膠。并用乙醇清洗，再離心5 min，以除去色素和游離的中性糖。重復(fù)上次步驟。

(7)將果膠放在的烘箱中46 ℃干燥7 h。稱量。

1.2.3 溶液配制

纖維素酶溶液的配置：將1 g纖維素酶溶解在100 mL容量瓶中，用蒸餾水配1%濃度的酶液，放置4 ℃冰箱備用。需要時(shí)取出稀釋配成0.2%，0.3%，0.4%，0.5%濃度的纖維素酶溶液。乙酸-乙酸鈉溶液，DPPH溶液等現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

慈橙果膠的提取，主要受酶溶液濃度，緩沖液pH，水浴溫度，料液比四個(gè)因素的影響比較大。所以在單因素試驗(yàn)的過(guò)程中其它三個(gè)條件不變，控制一個(gè)變量在合理的范圍內(nèi)變化，觀察，記錄并分析。

1.2.5 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，得出果膠提取的合理范圍。設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定纖維素酶法提取果膠的最優(yōu)工藝條件。

1.2.6 慈橙果膠抗氧化性分析

1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定[5]

吸取不同濃度的待測(cè)樣品1 mL，加入3.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液中，混合均勻，靜置40 min后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度A樣品；以相同比例的待測(cè)樣品與乙醇混合溶液為對(duì)照吸光度A對(duì)照、以DPPH溶液與乙醇的混合液為空白吸光度A空白，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次。DPPH自由基的清除率按下式計(jì)算：

參照陳留勇等[6]的鄰苯三酚法。取3.0 mL pH 8.2濃度50 mmol/L Tris-HCl緩沖液與2.5 mL蒸餾水混勻，加入3.0 mmol/L鄰苯三酚0.2 mL(以l0 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液)，搖勻后迅速測(cè)定325 nm波長(zhǎng)處吸光值。每個(gè)濃度重復(fù)三次。計(jì)算公式如下：

式中,ΔA0為鄰苯三酚線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值；ΔA為果膠樣品線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

1.2.6.3 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定[6]

按1:1:1:1的比例取H2O2、FeSO4、水楊酸-乙醇和不同濃度的樣品溶液各1 mL，最后加入H2O2，37 ℃反應(yīng)30 min，蒸餾水為空白對(duì)照A0，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度樣品的吸光度A1，不加顯色劑H2O2溶液的吸光度為A2。每個(gè)樣品測(cè)三次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)三次，三次試驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤(standard deviation，SD)得出結(jié)果。用GraphPad Prism 軟件分析后作圖，Student’s t-test來(lái)比較不同試驗(yàn)組中的差異顯著性分析。用SPSS16.0進(jìn)行Chi-square test分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶濃度對(duì)果膠得率的影響

取3.50 g 橙皮，分別加入濃度為0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，pH 4.8的纖維素酶溶液，46 ℃酶解6 h。酶濃度對(duì)慈橙皮果膠得率的影響如圖1所示。

圖1 酶濃度對(duì)果膠得率的影響

由圖1看出，其他條件不變的情況下，纖維素酶濃度在0.3%左右，果膠的得率最高。酶濃度低于或高于0.3%時(shí)，果膠得率都會(huì)下降，特別是當(dāng)酶濃度是0.5%時(shí)，果膠率發(fā)生了明顯的下降。

2.1.2 料液比對(duì)果膠得率的影響

改變橙粉與緩沖液的料液比，在1:5、1:10、1:15、1:20料液比中分別加入0.3%的纖維素酶，pH 4.8，46 ℃酶解6 h，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)果膠得率的影響

料液比直接影響可溶性果膠能否充分轉(zhuǎn)移到液相，同時(shí)也影響浸取液過(guò)濾的速度，以及蒸發(fā)濃縮時(shí)的能耗[8]。圖2可以看出，料液比小于 1:15 時(shí)，果膠得率隨料液比的增大而增大；當(dāng)料液比大于 1:15 時(shí)，果膠得率反而減小。這是因?yàn)楫?dāng)纖維素酶用量一定時(shí)，隨著料液比的增加，酶對(duì)細(xì)胞壁纖維素的降解能力增強(qiáng)，細(xì)胞壁被迅速破壞，果膠得以溶解出來(lái)；但隨著料液比增大到一定程度，造成酶的濃度相對(duì)減小，酶解能力降低，果膠得率降低[9]。

2.1.3 pH對(duì)慈橙皮果膠得率的影響

改變緩沖液pH為4.2，4.5，4.8，5.0，料液比1:15，0.3%纖維素酶，46 ℃酶解6 h，結(jié)果如圖3所示。

隨提取液pH的增大，果膠得率不斷增加，pH 4.8左右時(shí)果膠得率最大，之后隨著 pH 的增大，果膠提取率急劇下降。結(jié)果表明，用纖維素酶提取慈橙皮中的果膠適合在偏酸的條件下酶解，且最佳pH應(yīng)控制在4.8左右。

圖3 pH對(duì)果膠得率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)慈橙皮果膠提取率的影響

取pH 4.8，濃度為0.3%的纖維素酶溶液，料液比1:15，改變浸提溫度為42 ℃，46℃，50 ℃，54 ℃酶解6 h，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)果膠得率的影響

圖4表明酶解溫度在46 ℃以下時(shí)，隨著溫度的不斷升高，果膠得率逐漸增加；但溫度超過(guò)46 ℃后，隨著溫度的不斷升高，得率急劇降低。這是由于溫度會(huì)影響纖維素酶的活性，溫度太低纖維素酶的活性沒(méi)有完全釋放，溫度太高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性失活[9]。所以，最佳酶解溫度為 46 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

通過(guò)上面的單因素實(shí)驗(yàn)得出，纖維素酶濃度，提取溫度，料液比，pH 等因素對(duì)果膠提取影響較大，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定果膠提取的最佳工藝條件，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，根據(jù)極差R分析，RD最大，所以各因素對(duì)果膠得率的影響順序?yàn)椋毫弦罕?ph>溫度>酶濃度。得出最優(yōu)組合為 D2A2B2C2。即在料液1:15，pH 4.8，溫度46 ℃，酶濃度0.3%的情況下提取果膠最佳。

接著對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)了6組平行試驗(yàn)，得出平均果膠得率為14.32%，略高于正交表中最大得率；標(biāo)準(zhǔn)偏差STDEV為 0.209952，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.45%，證明最佳工藝重現(xiàn)性好。結(jié)果如表2所示。

表2 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 慈橙皮果膠抗氧化性結(jié)果分析

2.3.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

圖5 果膠對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖5可知，慈橙果膠對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，果膠濃度在0.4～1.6 mg/mL之間時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力并不隨著濃度的增長(zhǎng)而有明顯的清除效果趨勢(shì)；但是濃度在1.6～3.2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的敏感度大大增強(qiáng)，果膠的清除程度達(dá)到了40.89%；當(dāng)果膠質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，清除效果又沒(méi)有明顯的向上波動(dòng)的趨勢(shì)，總體維持在42%左右。與對(duì)照相比整體的清除作用不及維生素C。

2.3.2 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

圖6 果膠對(duì)羥自由基·OH的清除能力

由圖6可知，果膠對(duì)羥自由基的清除也有一定作用。清除程度隨著果膠的濃度增長(zhǎng)而增大。果膠質(zhì)量濃度在6.4 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基清除率達(dá)到36.8%。

圖7 果膠對(duì)超氧陰離子自由基·清除能力

3 結(jié)果與討論

纖維素酶法提取果膠條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，提取效率高，具有很好的發(fā)展前景。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)證明了慈橙皮果膠提取的最佳工藝條件為：溫度46 ℃，pH 4.8，料液比為1:15，酶濃度0.3%，在此條件下果膠得率為14.32%。高于蘇艷玲等[10]采取酶法提取柑橘皮果膠得率6.109%和劉義武等[11]酶法提取血橙皮果膠得率10.9%。

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Optimization of Extraction Technology and Antioxidant Activity of Pectin from Orange Peel*

WANGNan，ZHANGJing

(Jiaying University of life science, Guangdong Meizhou 514015, China)

Aimed to investigate the best conditions for extracting pectin from Pingyuan orange peel and the antioxidant activity of pectin in vitro, the extraction of pectin by using cellulase and the free radical scavenging activities of pectin on superoxide anion, DPPH and hydroxyl radicals were detected.The results showed that the optimal conditions were as follows: cellulase dose was 0.3%, temperature was 46 ℃, soild/liquid ratio (g/mL) was 1:15, pH was 4.8, under these conditions the extracting rate of pectin was 14.32% and had great potential for the development of functional foods due to its excellent antioxidant activity.

orange peel; pectin; cellulose; antioxidant activity

廣東省教育廳自然科學(xué)省級(jí)重大項(xiàng)目：多產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究(項(xiàng)目編號(hào)：2014KZDXM069)。

王楠(1986-)，女，講師，主要從事微生物天然化合物提取。

Q332

B

1001-9677(2016)019-0074-04