楊子琳，伍時(shí)華，黃翠姬，易弋

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

扣囊復(fù)膜酵母與釀酒酵母混合液態(tài)發(fā)酵改善糯米酒風(fēng)味的研究

楊子琳，伍時(shí)華*，黃翠姬，易弋

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

為了改善釀酒酵母單菌種液態(tài)發(fā)酵糯米酒的風(fēng)味，將扣囊復(fù)膜酵母3-1Y與釀酒酵母SJ4進(jìn)行混合發(fā)酵，比較混合發(fā)酵與釀酒酵母單菌種發(fā)酵糯米酒的差異性，并用PCA（主成分分析法）分析混合發(fā)酵糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)含量.結(jié)果表明：混合發(fā)酵與SJ4單菌種發(fā)酵相比，糯米酒中總酸和氨基酸態(tài)氮含量分別提高了17.3％，19.8％；甲醇、異丁醇、異戊醇的含量分別由417.4mg／L，321.3mg／L，4.4mg／L降至23.6mg／L，1.3mg／L，0.047mg／L；低級酯達(dá)到733mg／L，是SJ4單菌種發(fā)酵的3.47倍.總酸、氨基酸態(tài)氮、低級酯的升高及有害醇的降低均有效改善了糯米酒的風(fēng)味和口感；主成分分析混合發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)含量，得出風(fēng)味物質(zhì)的合成活性在發(fā)酵54 h期間達(dá)到最大值，為進(jìn)一步改善液態(tài)發(fā)酵糯米酒風(fēng)味提供理論基礎(chǔ).

糯米酒；混合發(fā)酵；風(fēng)味物質(zhì)；主成分分析

風(fēng)味物質(zhì)是衡量糯米酒質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，糯米酒中的風(fēng)味物質(zhì)主要和原料、酵母和陳釀有關(guān).在發(fā)酵過程中酵母對風(fēng)味物質(zhì)的形成有很重要的作用，大部分風(fēng)味物質(zhì)是酵母發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物［1］.早期研究認(rèn)為非釀酒酵母耐酒精能力差，在酒精發(fā)酵過程中的早衰現(xiàn)象會對酒的風(fēng)味和口感產(chǎn)生不利影響［2-3］.但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母合成風(fēng)味物質(zhì)的總含量往往是釀酒酵母的數(shù)倍甚至數(shù)十倍［4-5］，近幾年研究的重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到釀酒酵母與非釀酒酵母的混合發(fā)酵上［6］.同一酵母屬下各種酵母發(fā)酵特性不同，產(chǎn)生的代謝物也不相同，故發(fā)酵酒的風(fēng)味也就不同，不同屬之間的酵母所產(chǎn)生香氣物質(zhì)的差異更大，酒中風(fēng)味物質(zhì)的種類、含量與酵母菌種具有很高的相關(guān)性［7］.

以往的研究多注重工藝對其發(fā)酵結(jié)果的影響或片面追求產(chǎn)酒精度高的酵母菌［8］.本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，將扣囊復(fù)膜酵母和釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，比較混合發(fā)酵與釀酒酵母單菌種發(fā)酵的差異性，探究混合發(fā)酵的特點(diǎn)，為提高液態(tài)發(fā)酵糯米酒的質(zhì)量和風(fēng)味提供理論研究基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1原料柳州市某超市所售糯米.

1.2發(fā)酵菌株

表1　試驗(yàn)所用菌株Tab.1 Strains used in the experiment

1.3發(fā)酵菌懸液的制備

1.3.1霉菌孢子懸浮液的制備

霉菌孢子懸浮液制備方法按照應(yīng)玲云文獻(xiàn)［9］中所述方法.

1.3.2酵母菌懸液的制備

酵母菌懸浮液制備方法按照應(yīng)玲云文獻(xiàn)［9］中所述方法.

1.4培養(yǎng)基

1.4.1霉菌種子培養(yǎng)基［10］

200 g糯米加水浸泡4 h，將浸泡好的糯米瀝干后置于水浴鍋中，加水至剛剛浸沒糯米，待溫度上升至60℃時(shí)以10 U／g的接入量加入耐高溫ɑ－淀粉酶，90℃水浴保溫2 h，冷卻后過濾，加水定容至1 L，分裝成50mL／瓶，115℃下高壓蒸汽滅菌30min.

1.4.2酵母菌種子培養(yǎng)基［11］（g／L）

酵母浸膏10，葡萄糖20，蛋白胨20，自然pH，在115℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min.

1.4.3糯米液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

按照50 g／瓶的量，稱取糯米加水浸泡4 h后瀝干，加水至剛剛浸沒糯米置于水浴鍋中，待溫度上升至60℃時(shí)以10U／g的接入量加入耐高溫ɑ－淀粉酶，90℃保溫2 h，冷卻后加水定量至200 g／瓶，打漿，115℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min.

1.5分析方法

1.5.1理化成分分析方法

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮的測定參照《GBT 13662－2008黃酒》［12］的方法進(jìn)行.

1.5.2風(fēng)味物質(zhì)分析方法

TM－930白酒專用毛細(xì)管柱（25m×0.53mm×0.1μm）；載氣為N2；采用程序升溫：起始溫度45℃，恒溫3min，以3.5℃／min上升至62℃，以1℃／min上升至67℃，再以25℃／min上升至200℃，保持6min；進(jìn)樣口、檢測器溫度220℃；采樣結(jié)束時(shí)間30min.內(nèi)標(biāo)為乙酸丁酯，體積質(zhì)量為34.17mg／100mL.

1.5.3數(shù)據(jù)分析用Microsoft Excel，Origin和PCA對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.6混合發(fā)酵接種方式

扣囊復(fù)膜酵母3－1Y與釀酒酵母SJ4混合發(fā)酵采用順序接種方式：先將3－1Y以5×105個(gè)／mL的接種量接入滅菌后的液態(tài)糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床120 r／min，28℃條件下培養(yǎng)24 h，再以5×105個(gè)／mL的接種量接入釀酒酵母SJ4，繼續(xù)在搖床120 r／min，28℃的培養(yǎng)條件發(fā)酵66h，至培養(yǎng)基還原糖含量不再變化，結(jié)束發(fā)酵.

1.7液態(tài)釀造糯米酒的工藝流程圖

圖1　液態(tài)釀造糯米酒的工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for glutinous rice wine brewing

2　結(jié)果與分析

2.1混合菌種發(fā)酵對糯米酒理化性質(zhì)的改善作用

混合菌種發(fā)酵和SJ4單菌種發(fā)酵糯米酒的理化指標(biāo)如表2所示.比較混合發(fā)酵與SJ4單菌種發(fā)酵糯米酒的理化指標(biāo)：混合發(fā)酵糯米酒中總糖為6.53 g／L，酒精度為9.7％，與SJ4單菌種發(fā)酵糯米酒中總糖7.6 g／L，酒精度10.4％差異不顯著（P＞0.05）；糯米酒中適量的酸能起到調(diào)味解暴作用，是重要的調(diào)味物質(zhì)［13］，而酒中的氨基酸態(tài)反映酒中氨基酸的總量，是糯米酒主要的營養(yǎng)成分，直接體現(xiàn)糯米酒的質(zhì)量水平［14］.分析總酸和氨基酸態(tài)氮含量可知，混合發(fā)酵的糯米酒中總酸和氨基酸態(tài)氮比SJ4單菌種發(fā)酵分別高出17.3％，19.8％.總酸和氨基酸態(tài)氮含量的提高，豐富了酒體香味，明顯改善了糯米酒的品質(zhì).

表2　單一和混合菌種發(fā)酵糯米酒的發(fā)酵參數(shù)Tab.2 Fermentation parameters of single and mixed fermented glutinous rice wine

2.2混合菌種發(fā)酵對糯米酒風(fēng)味的改善作用

含量過高的異丁醇和異戊醇能夠引起飲用者頭痛，即所謂的“上頭”［15］.由表3可知，SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)異丁醇含量達(dá)321.3mg／L，嚴(yán)重影響了酒的品質(zhì).比較混合發(fā)酵與SJ4單菌種發(fā)酵，糯米酒中異丁醇、異戊醇的含量分別由SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)的321.3mg／L，4.4mg／L降至1.3mg／L，0.047mg／L，這對糯米酒品質(zhì)的改善有重要作用.酒中的甲醇對血管有麻痹及導(dǎo)致神經(jīng)變性作用，尤其損害視神經(jīng)，過多攝入嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致失明，黃酒中不應(yīng)含有甲醇［16］.混合發(fā)酵結(jié)束，糯米酒中的甲醇含量由SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)的417.4mg／L降至23.6mg／L.3－1Y與SJ4混合發(fā)酵顯著降低了糯米酒中有害醇的含量，混合發(fā)酵結(jié)束糯米酒中總高級醇含量僅有24.8mg／L.混合發(fā)酵的糯米酒中高級醇含量降低可能是由于3－1Y較低的發(fā)酵活力導(dǎo)致糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸無法高效氧化為乙醇，而是通過其它途徑轉(zhuǎn)化為乙酰－COA、乙酸和乳酸，導(dǎo)致混合發(fā)酵的糯米酒中總酸含量增高，并間接抑制其代謝副產(chǎn)物如高級醇的合成［17］，故需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究驗(yàn)證.

酯是一類具有特殊香味的有機(jī)化合物.主要包括脂肪酸乙酯和乙酸酯，它們能賦予酒體獨(dú)特的風(fēng)味，尤其是水果味和花香味［18］.比較混合發(fā)酵與SJ4單菌種發(fā)酵，糯米酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分別由SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)的45.7mg／L，0.46mg／L顯著增加至221.9mg／L，427.3mg／L，這2種物質(zhì)的提高對改善液態(tài)發(fā)酵糯米酒的口感和風(fēng)味有重要作用.乳酸乙酯主要帶來類似菠蘿香甜味的乙酯，能賦予糯米酒水果香味；具有類似香蕉味的己酸乙酯含量在混合發(fā)酵中僅提高了5.6％，增量不明顯，但丁酸乙酯含量卻由原來的154.5mg／L降至72.5mg／L.混合發(fā)酵的糯米酒中總低級酯含量達(dá)到733mg／L是SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)的3.47倍，明顯改善了糯米酒的風(fēng)味.

表3　單一和混合發(fā)酵糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)含量Tab.3 Content of flavor com pounds in different yeast inoculation ways to ferment glutinous rice wine mg／L

2.3主成分分析法分析混合發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)代謝

主成分分析（principal component analysis，PCA）也稱主分量分析，該方法利用降維的思想，將多指標(biāo)的變量通過線性變換、計(jì)算特征值等轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法［19］.如表4及續(xù)表4所示，混合發(fā)酵過程中糯米酒中9種主要風(fēng)味物質(zhì)含量，在Minitab 15分析軟件中運(yùn)用統(tǒng)計(jì)菜單下的主成分分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得到特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率、載荷表（表5）和分值圖（圖2）.

表4　混合發(fā)酵過程中糯米酒風(fēng)味物質(zhì)含量Tab.4 Content of flavor compounds during the mixed fermentation mg／L

續(xù)表4　混合發(fā)酵過程中糯米酒風(fēng)味物質(zhì)含量Continued Tab.4 Content of flavor com pounds during the mixed fermentation mg／L

由分析結(jié)果可知：第一主成分（PC1）所占比率為38.4％，第二主成分（PC2）所占比率為27.2％，第三主成分（PC3）所占比率為14.8％，3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為80.4％，分析結(jié)果可靠；在主成分分析中，載荷絕對值越大表示該項(xiàng)目與該主成分間的相關(guān)性越大，正負(fù)值分別代表正負(fù)相關(guān)，由表5可知，對第一主成分影響較大的依次為己酸乙酯、異丁醇，對第二主成分影響較大的依次為仲丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇，對第三主成分影響較大的依次為正丙醇、甲醇.

表5　混合發(fā)酵過程中主要風(fēng)味物質(zhì)載荷表Tab.5 Load table of flavor compounds during the mixed fermentation

由3D分值圖（圖2）可知，發(fā)酵102 h的糯米酒PC1值最高，為3.09，發(fā)酵66 h的PC2值最高為2.24，發(fā)酵19 h的PC3值最高為1.96.計(jì)算各發(fā)酵時(shí)間段的相對貢獻(xiàn)率（PC1×PC2×PC3）絕對值大小，分別為2.5879，1.008 9，2.2623，0.0383，1.6887，5.1039,0.1908，0.03675，0.5679，0.921 7，得出發(fā)酵54 h的糯米酒相對貢獻(xiàn)率最大為5.103 9，表明在發(fā)酵54 h的這段時(shí)間內(nèi)，酵母細(xì)胞中風(fēng)味物質(zhì)的代謝活動最為旺盛.

3　結(jié)論

注：0～9分別代表發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 hNote：0～9 respectively represent fermentation time：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 h

通過對扣囊復(fù)膜酵母和釀酒酵母混合液態(tài)發(fā)酵改善糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的研究，初步了解到2種酵母混合發(fā)酵的特點(diǎn).結(jié)果表明：混合發(fā)酵與SJ4單菌種發(fā)酵相比，糯米酒的酒精度及殘?zhí)橇坎町惒伙@著（P＞0.05），但混合發(fā)酵能提高糯米酒中總酸和氨基態(tài)氮含量.除此之外，混合發(fā)酵還能顯著改變糯米酒中的風(fēng)味物質(zhì)，不僅降低了對人體有害的甲醇、異丁醇、異戊醇的含量，同時(shí)合成更多低級酯，有效改善了糯米酒的質(zhì)量和風(fēng)味.PCA（主成分分析）分析得出混合發(fā)酵54 h左右的時(shí)間段是酵母次級代謝最為活躍、風(fēng)味物質(zhì)合成活性最高的時(shí)候，可在此段時(shí)間前加入微生物營養(yǎng)物質(zhì)，如碳源、氮源、微量元素等來進(jìn)一步改善糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)含量.

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（學(xué)科編輯：黎婭）

Research of mixed fermentation of saccharomycescerevisiae and saccharomycopsis fibuligera to improve flavor com pounds in glutinous rice wine by liquid fermentation

YANG Zi-lin1,WU Shi-hua*,HUANG Cui-ji,YI Yi
(School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China)

To improve the taste of glutinous rice wine fermented with S.cerevisiae single strain by mixing 3-1Y and SJ4,this paper compared the differences between mixture fermentation and pure fermentation of S.cerevisiae.Flavor substances content in glutinous rice wine were analyzed by PCA(principal component analysis).The results showed:by comparing mixed fermentation and pure fermentation of SJ4,total acid and amino nitrogen content in mixed fermentation were increased by 17.3％,19.8％respectively;the contents of Methanol,isoamyl alcohol and isobutanol in glutinous rice wine were reduced from 417.4mg/L,321.3 mg/L,4.4 mg/L to 23.6 mg/L,1.3 mg/L, 0.047mg/L respectively;the lower esters content was3.47 times as much as pure culture of SJ4 increase to 733mg/ L.The synthesis activity of flavor substances reaches its maximum at about 54h in the mixed fermentation which provide a theoretical basis to further improve the glutinous rice wine flavor.

glutinous rice wine;mixed fermentation;flavor compounds;principal components analysis

TS261.1

A

2095-7335（2016）03-0095-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.03.017

2016-04-14

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻0782003-2）資助.

＊伍時(shí)華，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：974499054＠qq.com.