楊秀榮 龍小雙

摘要：從患病加州鱸魚(yú)（Micropterus salmonides）體表分離到的斑替枝孢（Cladosporium bantianum）菌株，通過(guò)不同溫度和不同pH對(duì)斑替枝孢菌株生長(zhǎng)速率的影響來(lái)研究其生物學(xué)特性，再以草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）為感染對(duì)象，用該菌進(jìn)行回復(fù)感染，對(duì)其致病性作初步研究。結(jié)果表明，斑替枝孢在pH 5～11均能生長(zhǎng)，pH為9.0時(shí)生長(zhǎng)最快；在溫度為5～35 ℃時(shí)均能生長(zhǎng)，以20 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，菌落最為致密。在實(shí)驗(yàn)室條件下，單一菌株對(duì)草魚(yú)和鯉魚(yú)不具有致病性。

關(guān)鍵詞：斑替枝孢（Cladosporium bantianum）； 生物學(xué)特性； 致病性

中圖分類號(hào)：S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-0901-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.021

The Preliminary Study of Biological Characteristics and Pathogenicity about Cladosporium bantianum

YANG Xiu-rong，LONG Xiao-shuang

（Zunyi Normal College， Life Sciences Institute/Key Laboratory of Regional Characteristic for Conservation and Utilization of Plant Resource in Chishui River Basin，Zunyi 563002， Guizhou，China）

Abstract： Cladosporium bantianum bacterial strain was isolated from body surface of Micropterus salmonides，which was cultivated with different temperature and pH. The preliminary study of biological characteristics were proceed on basis of growth velocity under different temperature and pH. The preliminary study of pathogenicity were proceed on basis of reply infection with Ctenopharyngodon idellus and Cyprinus carpio. The result showed that C. bantianum could grow when the pH from 5.0 to 11.0， which grew fastest when the pH was 9.0； it could grow from 5 to 35 ℃， but the fastest grow was 20 ℃. In laboratory， the sole bacterial strain had not pathogenicity for C. idellus and C. carpio.

Key words： Cladosporium bantianum； biological characteristics； pathogenicity

加州鱸魚(yú)（Micropterus salmonides）原名大口黑鱸，分類學(xué)上屬鱸形目（Perciformes），太陽(yáng)魚(yú)科[1]，身體長(zhǎng)而側(cè)扁，稍紡錘形，橫截面為橢圓形。全身覆蓋銀白色或淡黃色細(xì)密鱗片，但脊柱顏色較深，通常呈綠青色或淡黑色，同時(shí)沿側(cè)線附近常有黑色斑紋。腹部呈灰白色。背肉稍厚，墨綠色，體側(cè)青綠。生活在淡水湖泊，原產(chǎn)自美洲，1983年引進(jìn)中國(guó)進(jìn)行養(yǎng)殖，通過(guò)人工馴化后，性格較溫和，不喜歡跳躍，容易受到驚嚇。加州鱸魚(yú)通?？梢栽?%以下的咸淡水域中正常生長(zhǎng)，水質(zhì)要求每升水溶氧量在1.5 mg以上，比鱸魚(yú)、鱖魚(yú)耐低氧能力強(qiáng)[2]。鱸魚(yú)肉是高蛋白食物，維生素A和維生素B豐富，滋補(bǔ)肝腎，健脾和胃，而且對(duì)感冒止咳有很好的功效，能化痰止咳，含有豐富的微量元素鈣、鎂、鋅、硒等。加州鱸魚(yú)生長(zhǎng)迅速，肉質(zhì)鮮美，容易養(yǎng)殖，且經(jīng)濟(jì)效益高，是中國(guó)常見(jiàn)的淡水養(yǎng)殖品種。草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）屬鯉形目鯉科，是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，它和鰱、鳙、青魚(yú)一起，構(gòu)成了中國(guó)著名的“四大家魚(yú)”[3]。

本研究所用菌株是從患病加州鱸魚(yú)體表分離，通過(guò)分子鑒定和形態(tài)鑒定，初步鑒定為斑替枝孢（Cladosporium bantianum），屬真菌門(mén)（Fung）半知菌亞門(mén)（Deuter omycota）絲孢綱（Hyphomycetes）叢梗孢目（Miniliales）暗色孢科（Dematiaceae）枝孢屬（Cladosporium）。能引起皮膚暗色絲孢霉病[4]，尤其侵染腦部引起腦囊腫或膿腫，少數(shù)為腦膜炎[5]。在PDA和PCA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落扁平。鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面有不規(guī)則皺褶，37 ℃生長(zhǎng)良好。在Sabourand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色。菌絲灰棕色，分生孢子橢圓形、梨形、鏈生[6]。

為研究斑替枝孢的生物學(xué)特性和對(duì)其他淡水魚(yú)類的致病性，本試驗(yàn)通過(guò)不同pH和不同溫度條件對(duì)該真菌的生長(zhǎng)狀況和菌落大小的影響，研究該真菌的生物學(xué)特性。同時(shí)將該真菌回復(fù)感染草魚(yú)和鯉魚(yú)，觀察真菌對(duì)草魚(yú)和鯉魚(yú)是否具有致病性，為淡水魚(yú)類的中草藥防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

該菌株分離自患病加州鱸魚(yú)體表潰爛處，在PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，將獲得的純培養(yǎng)菌株保存于5 ℃冰箱備用。菌株的分離與鑒定見(jiàn)魏福倫等[6]的報(bào)道。

1.2 方法

1.2.1 不同pH對(duì)斑替枝孢的影響 將該真菌接種在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察真菌菌株的生長(zhǎng)狀況，每隔24 h觀察一次，采用十字交叉法測(cè)定真菌菌落直徑并記錄下來(lái)。每個(gè)梯度做3個(gè)平板，試驗(yàn)周期為15 d。

1.2.2 不同溫度對(duì)斑替枝孢的影響 將該真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培養(yǎng)，觀察真菌菌株的生長(zhǎng)狀況，測(cè)量其直徑記錄下來(lái)。每個(gè)梯度做3個(gè)平板，測(cè)量方法同上。試驗(yàn)周期為14 d。

1.2.3 斑替枝孢的致病性 用于回復(fù)感染的淡水魚(yú)是草魚(yú)和鯉魚(yú)，取自烏江網(wǎng)箱[7]。取回后置自然條件下培養(yǎng)，待魚(yú)在自然環(huán)境中生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定后進(jìn)行回復(fù)感染。每組10尾魚(yú)裝到養(yǎng)魚(yú)箱中，每次試驗(yàn)3箱魚(yú)，一箱為對(duì)照組，另兩箱為試驗(yàn)組。對(duì)照組將真菌菌株接種在魚(yú)胸鰭下，放進(jìn)魚(yú)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)組一箱魚(yú)直接刮入真菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，另一箱魚(yú)在魚(yú)胸鰭下接種真菌菌株。每24 h觀察一次，觀察該菌對(duì)淡水魚(yú)是否具有致病性。記錄每天的觀察結(jié)果，試驗(yàn)周期為20 d。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用SPSS_Statistics-v19.0win32軟件進(jìn)行差異性計(jì)算，用SPSS軟件的單樣本t檢驗(yàn)計(jì)算t值及Sig.（雙側(cè)）值。將Sig.（雙側(cè)）值與p值進(jìn)行比較，p值表示概率，得出差異性是否顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)斑替枝孢的影響

由表1、圖1可知，斑替枝孢在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的條件下均能生長(zhǎng)。由表1可知，t值各不相同，但Sig.（雙側(cè)）值均為0.000，小于顯著水平0.05，與t檢驗(yàn)的零假設(shè)相符，即不同pH之間菌落生長(zhǎng)速率存在顯著差異（接種菌餅均為2 mm）。pH 9.0時(shí)，真菌生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑達(dá)52.3 mm，菌落最為致密，pH 7.0、8.0時(shí)，真菌生長(zhǎng)速度也相對(duì)較快，菌落直徑分別達(dá)51.3、52.0 mm，因此最適生長(zhǎng)的pH為9.0。

2.2 不同溫度對(duì)斑替枝孢的影響

真菌的生長(zhǎng)狀況在不同溫度下有明顯的差異，在溫度低于5 ℃和高于35 ℃時(shí)，均不能生長(zhǎng)（接種菌直徑為2 mm）。在10～30 ℃范圍內(nèi)，該菌的生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而增快，在20 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，菌落直徑達(dá)61.7 mm，菌落最為致密。25 ℃時(shí)，真菌生長(zhǎng)速度也相對(duì)較快，菌落大小為58.7 mm，但菌落不如20 ℃時(shí)致密。因此20 ℃為斑替枝孢的最適生長(zhǎng)溫度。用SPSS軟件計(jì)算t值和Sig.（雙側(cè)）值，t值各不相同，Sig.（雙側(cè)）值均小于顯著水平0.05，與t檢驗(yàn)的零假設(shè)不相符，存在顯著性差異（表2、圖2）。

2.3 斑替枝孢的致病性

將真菌菌株接種于草魚(yú)和鯉魚(yú)，培養(yǎng)后觀察，發(fā)現(xiàn)此菌株對(duì)草魚(yú)和鯉魚(yú)的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，沒(méi)有引起淡水魚(yú)患病或死亡。在魚(yú)體的傷口周圍取材進(jìn)行再培養(yǎng)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)埃里格孢，初步判斷斑替枝孢不感染草魚(yú)和鯉魚(yú)，單一菌株的斑替枝孢可能對(duì)淡水魚(yú)無(wú)致病性。

3 小結(jié)與討論

斑替枝孢是枝孢屬真菌，屬半知菌亞門(mén)，菌絲體淡褐色至褐色，有時(shí)產(chǎn)生子座。斑替枝孢又叫毛樣枝孢霉、枝孢樣枝孢霉，為腐生真菌，廣泛存在于自然界的土壤、某些動(dòng)物的糞便、蔬菜、腐木、鳥(niǎo)巢、腐爛水果中[8]，而從魚(yú)類體表潰爛傷口分離該菌株則屬首次。

為了對(duì)斑替枝孢引起的病害進(jìn)行有效防治，對(duì)從患病加州鱸魚(yú)體上分離的該菌進(jìn)行生物學(xué)特性的研究。研究結(jié)果表明，該菌株在PDA培養(yǎng)基上pH為5.0～11.0時(shí)均能生長(zhǎng)，以pH 9.0時(shí)生長(zhǎng)最快，菌落最為致密，直徑達(dá)52.3 mm，為該真菌最適生長(zhǎng)pH。該真菌在不同溫度下有明顯的差異，在溫度低于5 ℃和高于35 ℃時(shí)，均不能生長(zhǎng)。在20 ℃時(shí)該菌生長(zhǎng)較快，菌落直徑達(dá)61.7 mm，菌落最為致密，為斑替枝孢的最適生長(zhǎng)溫度。表明該菌對(duì)于溫度、pH等條件適應(yīng)范圍廣，要求不嚴(yán)格，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。

將該真菌單一接種于草魚(yú)和鯉魚(yú)，并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)草魚(yú)和鯉魚(yú)的致病性，這有可能是水質(zhì)問(wèn)題影響了試驗(yàn)的結(jié)果，該菌是否有可能與其他病原菌相互作用、交叉感染而導(dǎo)致淡水魚(yú)類患病，還有待下一步驗(yàn)證。此次試驗(yàn)結(jié)果為下一步研究該菌對(duì)淡水魚(yú)的致病性提供了一定的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈玉幫，張俊彬，李家樂(lè).草魚(yú)種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（7）：369-373.

[2] 王 偉，馬淑華.加州鱸魚(yú)的池塘養(yǎng)殖[J].遼寧師專學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999（1）：97-100.

[3] 伍 律.貴州魚(yú)類志[M].貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1989.

[4] 桑 紅，鄧德權(quán)，謝其美，等.暗色絲孢霉病的臨床及研究現(xiàn)況[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2008（4）：242-246.

[5] 張忠義.中國(guó)真菌志：第十四卷[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[6] 魏福倫，朱里鵬，王慶容.3株鱸魚(yú)體表可疑性致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：187-190.

[7] 楊秀榮，曾燕玲，魏志琴.烏江網(wǎng)箱養(yǎng)殖患病加州鱸魚(yú)的細(xì)菌分離鑒定與回復(fù)感染[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：252-254.

[8] 桑 紅，鄧德權(quán)，何 威.枝孢樣枝孢霉的研究概況[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010（1）：57-60，64.