黃金野 張晶鈺 柴龍會 劉菁菁 肖向紅

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

HPLC法測定藍狐膽汁酸成分與含量

黃金野 張晶鈺 柴龍會 劉菁菁 肖向紅*

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

修回日期：2016-02-18

發(fā)表日期：2016-05-10

高效液相色譜；

目前國內(nèi)毛皮動物養(yǎng)殖規(guī)模逐年壯大，其中貂(Martesspp.)、狐(Vulpesspp.)、貉(Nyctereutesspp.)3大毛皮動物的養(yǎng)殖數(shù)量更居世界首位，歷史最高年份3種毛皮動物養(yǎng)殖總量逾5 000萬只，占世界毛皮動物養(yǎng)殖總量的50%[1]。數(shù)量如此巨大的毛皮動物在冬季取皮后，其胴體、內(nèi)臟、骨骼能得到有效利用，但大量的膽囊膽汁被丟棄浪費，特別是膽汁中的膽汁酸。膽汁酸具有諸多的生理功能，可以促進脂肪和脂溶性物質(zhì)的消化吸收[2]，或作為一種激素參與膽固醇的代謝，使動物體內(nèi)膽固醇的代謝處于一種動態(tài)平衡。膽汁酸不僅具有保肝利膽，維護動物機體健康的作用，還具有鎮(zhèn)咳、平喘、消炎、抗過敏以及抑菌等作用[3]。此外有研究表明膽汁酸與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，迄今為止國內(nèi)外對動物膽汁的分離研究較多[5-10]，唯獨缺少對狐膽汁的相關(guān)研究，本實驗室前期研究結(jié)果顯示狐膽囊膽汁對離體蟾蜍(Bufosp.)心臟具有正性作用，并對狐膽汁進行初步分離[11-12]。本實驗以藍狐(北極狐，Vulpeslagopus)膽囊膽汁為實驗材料，利用高效液相色譜技術(shù)測定其膽汁酸成分與含量，為狐膽囊膽汁酸的研究與有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

高效液相色譜法是現(xiàn)今化學(xué)學(xué)科中最具有優(yōu)勢的分離分析方法之一。與其他分離分析方法相比高效液相色譜法具有良好的穩(wěn)定性。對相同樣品的分離效果基本保持不變，具有極好的穩(wěn)定性，多次重復(fù)可以獲得重現(xiàn)性良好的實驗結(jié)果。在食品、制藥、環(huán)境監(jiān)測、生物工程、生物化學(xué)和精細化工等許多領(lǐng)域都作為重要技術(shù)在使用。在生物制品的分離分析領(lǐng)域，尤其是在復(fù)雜成分的動物膽汁的分離分析領(lǐng)域具有權(quán)威性和通用性。

1 儀器與試劑

Waters600E高效液相色譜儀；Waters SunFireTMC185μm色譜柱(尺寸4.6 mm×150 mm)；Waters 2487雙通道紫外檢測器；天津奧特賽斯儀器有限公司超聲波清洗機、溶劑過濾器；梅特勒-托利多儀器有限公司電子分析天平、pH計；北京四環(huán)科學(xué)儀器廠冷凍干燥機；Milli-Q超純水儀；J.T.Baker甲醇(色譜級)；天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司KH2PO4、K2HPO4、H3PO4；北京百靈威科技有限公司膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)；Sigma-Aldrich公司去氧膽酸(DCA)、?；悄懰徕c鹽水合物(TCANa·nH2O)、牛磺去氧膽酸鈉鹽水合物(TDCANa·nH2O)；中國藥品生物制品檢定所?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 標(biāo)準品溶液制備

精密稱取少量標(biāo)準品于進樣瓶中，用1 mL甲醇充分溶解后備用。制得標(biāo)準品溶液濃度分別為膽酸(CA)12.1 g/L、去氧膽酸(DCA)12.7 g/L、鵝去氧膽酸(CDCA)15.4 g/L、熊去氧膽酸(UDCA)10.8 g/L、?；悄懰?TCA)3.4 g/L、?；侨パ跄懰?TDCA)2.3 g/L、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)1.4 g/L、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)2.5 g/L。

2.1.2樣品溶液制備

新鮮藍狐膽囊膽汁(采自黑龍江農(nóng)業(yè)實驗基地狐貉飼養(yǎng)場)在-20℃下冷凍72 h后置于冷凍干燥機中制成凍干粉[13]，每100 g藍狐膽囊膽汁可得狐膽粉(2.74±0.63)g，獲取率為3.37%～2.11%。精密稱取凍干粉350 mg，溶于50 mL甲醇中，超聲波溶解10 min(功率300 W，頻率25 kHz)，經(jīng)0.45 μm脂溶性微孔濾膜濾過，取濾液置于50 mL容量瓶中，加入甲醇并稀釋至刻度線。作為待測樣品溶液備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為WatersC18，流動相為甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液濃度為0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，采用流速1.1 mL/min，等度洗脫，檢測波長為205 nm。色譜圖見圖1。

各色譜峰保留時間見表1。

表1保留時間

Tab.1 Retention time

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性

分別精密稱取標(biāo)準品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL進樣分析，測定峰面積值。按照以進樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，并得到回歸方程(表2)。結(jié)果顯示在所示范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 藍狐膽囊膽汁樣品Fig.1 Blue Fox bile samples

表2 線性關(guān)系

Tab.2 Linear relationship

2.3.2 精密度

分別取標(biāo)準品溶液10 μL在最優(yōu)色譜條件下重復(fù)5次進樣分析。對測定的標(biāo)準品的色譜峰保留時間和面積數(shù)據(jù)進行精密度分析(表3)，結(jié)果RSD值(相對標(biāo)準偏差)均小于2%說明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性

依照2.1.2樣品溶液制備方法，將5份藍狐膽汁樣品制成樣品溶液，在最優(yōu)色譜條件下分別進樣10 μL分析測定，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表4。

表3 精密度試驗結(jié)果

Tab.3 Results of precision test

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果

Tab.4 Results of repeated experiments

依據(jù)重復(fù)性實驗表對8個色譜峰分別計算RSD值均小于2%，結(jié)果表明樣品的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性

取樣品溶液分別在0、1、3、5、7、9、12、24 h進樣測定，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

Tab.5 Results of stability test

所得色譜圖中峰面積的RSD值均小于2%，結(jié)果表明各峰的穩(wěn)定性良好。

2.4 成分與含量測定

由圖1、表1～表3可知藍狐膽汁中含有牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)、?；悄懰?TCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)和牛磺去氧膽酸(TDCA)見圖2，利用峰面積數(shù)據(jù)與膽粉獲取率進行定量分析，可知上述膽汁酸分別約占藍狐膽囊膽汁質(zhì)量的0.010 1%、0.171 8%、0.039 6%和0.079 9%。

圖2 藍狐膽囊膽汁樣品與標(biāo)準品(1.牛磺去氧膽酸標(biāo)品，2.?；蛆Z去氧膽酸標(biāo)品，3.?；悄懰針?biāo)品，4.牛磺熊去氧膽酸標(biāo)品，5.狐膽汁樣品)Fig.2 Chromatogram of blue fox bile samples and chromatogram of standard samples (1.TDCA，2.TCDCA，3.TCA，4.TUDCA，5.Blue fox bile)

3 討論

液相色譜技術(shù)中樣品的分離效果與流動相、色譜柱柱溫、流動相pH、流速等因素有關(guān)。在優(yōu)化流動相組成時，先后用甲醇、乙腈、純水以及磷酸鹽溶液中的一種或幾種溶液篩選流動相，其中以甲醇-磷酸鹽溶液體系的分離效果最佳。實驗過程中發(fā)現(xiàn)增加流動相中的甲醇比例可提高分離效率，但會影響分離效果。當(dāng)甲醇比例降低至20%甚至以下時，可將本實驗圖1中1、2號峰進一步分離。實驗過程中調(diào)整磷酸鹽濃度可以影響色譜峰的峰型，當(dāng)濃度為0.25～0.35 mol/L時峰型較好。流動相pH也是本實驗中影響樣品分離效果的一個重要因素，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用磷酸調(diào)節(jié)磷酸鹽溶液的pH范圍在3～4時分離效果良好，綜上所述，本試驗確定色譜條件為：色譜柱Waters C18，流動相甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液濃度0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，等度洗脫，流速1.1 mL/min，檢測波長205 nm。用此色譜條件分離藍狐膽囊膽汁獲得4種膽汁酸分別為：?；切苋パ跄懰?TUDCA)、?；悄懰?TCA)、牛磺鵝去氧膽酸(TCDCA)和?；侨パ跄懰?TDCA)。利用該方法分離藍狐膽囊膽汁酸效果良好，具有操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點，此方法可為狐膽囊膽汁質(zhì)量標(biāo)準制定提供參考。

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HPLC(High-performance liquid chromatography)；Fox bile；Bile acid；Content

HPLCDeterminationofBlueFoxBileAcidCompositionandContent

HuangJinyeZhangJingyuChaiLonghuiLiuJingjingXiaoXianghong*

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

We developed a method to assess the bile acid composition and content of blue fox(Vulpeslagopus)by high-performance liquid chromatography(HPLC)with ultra-violet(HPLC-UV).We used Waters C18and the mobile phase was methanol and KH2PO4，concentration of KH2PO4solution was 0.25-0.35 mol/L(pH=3-4)，isocratic elution.The flow rate was 1.1 mL/min and the detection wavelength was 205 nm.Blue fox bile contained TUDCA，TCA，TCDCA and TDCA，accounting for 0.0101%，0.1718%，0.0396% and 0.0799% of blue fox gallbladder bile quality，respectively.Each component of blue fox bile showed good linear relation.This analytical method proved reliable，accurate，and repeatable，and it can be used to assay the bile acid composition and content of blue fox.These results are important for the development and utilization of blue fox bile.

稿件運行過程

2016-01-11

狐膽汁；

膽汁酸；

含量測定

S865.2+3

A

2310-1490(2016)02-108-05

建立測定藍狐(Vulpeslagopus)膽汁酸成分與含量的高效液相色譜方法。其方法為：采用HPLC-UV法，色譜柱為Waters C18，流動相為甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液濃度為0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，等度洗脫，流速為1.1 mL/min，檢測波長為205 nm。結(jié)果：藍狐膽囊膽汁中含?；切苋パ跄懰?TUDCA)、?；悄懰?TCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)和牛磺去氧膽酸(TDCA)，分別約占藍狐膽汁質(zhì)量的0.010 1%,0.171 8%,0.039 6%和0.079 9%。結(jié)論：膽汁酸各組分的線性關(guān)系良好，本方法準確可靠，重復(fù)性好，可用于測定藍狐膽汁酸成分及含量，對合理開發(fā)和利用藍狐膽汁資源具有積極意義。

黃金野，男，26歲，碩士研究生；主要從事生理學(xué)研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com