顏 珣，韓日疇

(廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

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生物殺蟲劑-昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)技術(shù)

顏 珣，韓日疇*

(廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

昆蟲病原線蟲是新型的生物殺蟲劑，對鉆蛀及土棲性害蟲防效較好，具有部分替代化學(xué)農(nóng)藥的潛力。昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)是昆蟲病原線蟲商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。本文介紹了目前世界上常用的昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)方法，包括活體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的技術(shù)，這些技術(shù)的應(yīng)用有助于昆蟲病原線蟲的種質(zhì)保存及培養(yǎng)，為拓展昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

昆蟲病原線蟲；大量培養(yǎng)；昆蟲活體培養(yǎng)；體外固體培養(yǎng)；體外液體培養(yǎng)

昆蟲病原斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis線蟲是國際上新型的高效生物殺蟲劑(Georgisetal.，2006)，從二十世紀30年代開始就被用于害蟲的防治(Smart，1995)，具有殺蟲能力強，殺蟲譜廣，能主動搜索寄主，對人畜、環(huán)境安全等優(yōu)點，易于大量培養(yǎng)及配制產(chǎn)品，并能與多種化學(xué)農(nóng)藥混用，對鉆蛀及地下害蟲有特效(顏珣等，2014)。

昆蟲病原線蟲的生活史起始于感染期幼蟲(Infective juveniles，IJ)攜帶共生細菌進入寄主昆蟲活體，感染期幼蟲避開昆蟲的免疫反應(yīng)，在昆蟲血淋巴內(nèi)釋放共生細菌(Dowds and Peters，2002)。共生細菌在昆蟲血淋巴內(nèi)增殖，殺死寄主昆蟲，線蟲取食共生細菌以繁殖。當昆蟲活體營養(yǎng)耗盡，3齡耐受態(tài)感染期幼蟲形成，在外界環(huán)境足夠濕潤且溫度適宜時，感染期幼蟲攜帶共生細菌離開寄主昆蟲(Brown and Gaugler，1997)，搜尋新的寄主。感染期幼蟲是昆蟲病原線蟲生活史中唯一能自由存活的齡期，可使用普通的噴霧器進行施用以防治害蟲。感染期幼蟲能存活1到多個月，可進行產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)(Wrightetal.，2005)。

昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)是昆蟲病原線蟲推廣及商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。昆蟲病原線蟲可以通過寄主昆蟲進行活體培養(yǎng)，亦可以在體外通過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)或用發(fā)酵罐進行液體培養(yǎng)。昆蟲病原線蟲的體外培養(yǎng)需要共生細菌的參與，共生細菌可將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成昆蟲病原線蟲生長發(fā)育繁殖所需的成分(Dowds and Peters，2002)。進行昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)是最合算的，但是固體培養(yǎng)和活體培養(yǎng)同樣重要，固體培養(yǎng)在勞動力便宜的國家和地區(qū)更為適用，因為所需要的前期投入少；活體培養(yǎng)則適合于實驗室內(nèi)種質(zhì)保存及小量實驗。這3種培養(yǎng)技術(shù)的詳細介紹如下。

1 昆蟲活體培養(yǎng)

昆蟲寄主活體培養(yǎng)是早期昆蟲病原線蟲應(yīng)用的培養(yǎng)方式，1970年就開始有公司用大蠟螟Galleriamellonella生產(chǎn)昆蟲病原線蟲。從十九世紀80年代開始，有多種線蟲是應(yīng)用寄主昆蟲進行大量生產(chǎn)并銷售的(Poinar and Grewal，2012)。在昆蟲病原線蟲體外培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來之前，活體培養(yǎng)適宜小批量生產(chǎn)昆蟲病原線蟲，目前仍適合小作坊。

寄主活體培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的策略是使用敏感、可靠又相對便宜的昆蟲寄主來培養(yǎng)昆蟲病原線蟲。與其他寄主昆蟲相比，大蠟螟對大部分昆蟲病原線蟲品種敏感，生產(chǎn)廠家較多，每條大蠟螟的產(chǎn)量可達到1-3.5×105頭感染期幼蟲，是目前最理想的可用于昆蟲病原線蟲活體培養(yǎng)的寄主昆蟲(Dutkyetal.，1964；Milstead and Poinar，1978)。但有些昆蟲病原線蟲品種在大蠟螟活體無法繁殖，則可用黃粉蟲Tenebriomolitor、金龜子或者其他直翅目昆蟲來培養(yǎng)(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)?；铙w培養(yǎng)包括線蟲接種、線蟲收集、線蟲清洗及收獲等步驟。

1.1 培養(yǎng)技術(shù)

接種線蟲可以通過噴霧器噴線蟲懸液，或者將寄主昆蟲浸泡在線蟲液中，而最普遍的方法是將線蟲接種到昆蟲上。寄主昆蟲的密度和接種量需根據(jù)不同的線蟲及寄主昆蟲的品種進行優(yōu)化，劑量過低，寄主死亡率低，劑量過高，會因為與二次入侵的感染期幼蟲之間產(chǎn)生競爭而導(dǎo)致感染失敗(Woodring and Kaya，1988；Shapiro-Ilanetal.，2002)，因此有必要選擇合適的接種量以獲得最高的產(chǎn)量。以大蠟螟為寄主時，一般是25-200 IJ每頭蟲的接種量，而以黃粉蟲為寄主時，一般是100-6000 IJ每頭蟲的接種量(Boffetal.，2000)。此外，寄主過多擁擠時會導(dǎo)致缺氧及產(chǎn)生大量的氨氣，從而影響線蟲的產(chǎn)量(Shapiro-Ilanetal.，2002)。

活體培養(yǎng)的線蟲是以White(1972)建立的方法為原理進行收集的，稱為水誘集法(White trap)。水誘集法包含一個容器放置昆蟲病原線蟲致死的蟲尸，這個容器放置于另一個更大的容器中，形成一個小島，底部浸泡在水中，感染期幼蟲爬出蟲尸后爬入水中，方便收集?；旧夏壳八袑嶒炇叶加酶牧歼^的水誘集法來收集培養(yǎng)的昆蟲病原線蟲(Lindegrenetal.，1993)。Carne and Reed(1964)發(fā)明的一種收集線蟲的自動裝置，是將感染的蟲尸放置于一個碟子上，碟子上留有一個缺口連接著漏斗，容器內(nèi)的水通過自動裝置穩(wěn)定在剛好接觸蟲尸的水平。當線蟲從蟲尸爬出碟子時，沉降到漏斗的底部，打開活塞即可收集線蟲。

收集的感染期幼蟲必須進行清洗和濃縮，將線蟲與蟲尸殘留物、細菌和其他齡期分開，以避免其他微生物的污染從而縮短貨架時間。通常是將收集的線蟲液通過一層濾膜，感染期幼蟲爬過濾膜，其他物質(zhì)則保留在濾膜上(Gaugler and Brown，2001)。Shapiro-Ilan等(2014a)介紹了一種單一容器的設(shè)計，將被線蟲感染的蟲尸直接放置于用于劑型配制的介質(zhì)上，存放于最終的包裝中，感染期幼蟲一爬出就移除蟲尸，制成的線蟲劑型產(chǎn)品就可以直接用于運輸或儲存。這種流水線式的方法，免除了額外的濃縮和包裝的步驟，使線蟲一孵出就能直接被做成劑型并包裝。另外一種活體培養(yǎng)的流水線方法是直接生產(chǎn)和應(yīng)用昆蟲病原線蟲感染的寄主昆蟲。這種方法直接將昆蟲病原線蟲感染的寄主蟲尸施放到田間，線蟲孵出后直接于田間防控害蟲，減少了收集和濃縮線蟲的勞力成本(Shapiro-Ilanetal.，2001)。直接施用昆蟲病原線蟲感染的寄主蟲尸對害蟲的防控效果顯著(Janssonetal.，1993；Jansson and Lecrone，1994)。研究表明，從蟲尸中出來的線蟲在土壤中的感染力和擴散力均比通過懸液施用的線蟲要強(Shapiro-Ilan and Glazer，1996；Shapiro-Ilan and Lewis，1999)。由于大蠟螟蟲尸本身比較脆弱，Shapiro-Ilan 等(2001)人研究用一層淀粉或黏土等作為衣膜包裹蟲尸制成蟲尸劑，可以提高蟲尸的干燥耐性和儲存性，阻止蟲尸腐爛及粘連。如果寄主昆蟲用黃粉蟲，由于蟲體較硬，且表面平滑，則不容易腐爛或粘連。小區(qū)實驗表明，線蟲用黃粉蟲蟲尸施用時，防治柑橘象鼻蟲Diaprepesabbreviatus和葡萄黑耳喙象Otiorhynchussulcatus的效果好于懸液噴施(Shapiro-Ilanetal.，2003)。

1.2 影響因素

寄主昆蟲活體培養(yǎng)的線蟲產(chǎn)量受多種因素影響，與寄主大小成正相關(guān)，與線蟲大小成負相關(guān)，但是在選擇寄主昆蟲及線蟲時仍需考慮單頭寄主昆蟲生產(chǎn)線蟲的成本；線蟲的產(chǎn)量還與溫度、通氣及濕度等環(huán)境因子有關(guān)(Gaugler and Han，2002；Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。用活體培養(yǎng)的方法大量生產(chǎn)線蟲時，溫度容易控制，但濕度和通氣比較難隨規(guī)模的擴大而保持。溫度是培養(yǎng)過程中一個重要參數(shù)，會影響產(chǎn)量及線蟲收獲的時間(Grewaletal.，1994)。使用大蠟螟進行培養(yǎng)的最佳溫度在18℃-28℃，根據(jù)線蟲種類不同而不同：比如耐冷的某些S.feltiae線蟲品系最適合于18.5℃培養(yǎng)，耐熱品種S.riobrave適合在28℃培養(yǎng)，而S.carpocapsae則適合于25℃培養(yǎng)。除溫度外，充足的通氣和一定的濕度在培養(yǎng)過程中也是必須的。要確保培養(yǎng)過程中有充足的通氣，以防止氨氣及其他有害氣體的累積(Woodring and Kaya，1988)。濕度必須控制在不飽和與太干之間，濕度飽和會誘導(dǎo)成蟲離開蟲尸，容易引起真菌和細菌的污染，蟲尸容易被蚤蠅幼蟲破壞，導(dǎo)致線蟲無法生長。為保證濕度，培養(yǎng)系統(tǒng)通常是獨立封閉的，但不封實以確保通氣，或者用透氣膜封口以防治蚤蠅的感染。

1.3 優(yōu)缺點

昆蟲病原線蟲的活體培養(yǎng)需要的前期投入中等，操作簡單，但產(chǎn)出相對較低，需要飼養(yǎng)昆蟲且勞動成本高，適于培養(yǎng)昆蟲病原線蟲用于實驗室內(nèi)的生物測定等實驗，及線蟲種質(zhì)資源的保存和維護。

2 體外人工飼料培養(yǎng)

昆蟲病原線蟲的感染期幼蟲通常是要感應(yīng)到昆蟲血淋巴中的特異化合物后才開始發(fā)育。研究表明是昆蟲血淋巴內(nèi)一種熱穩(wěn)定且對蛋白酶不敏感的低分子量化合物啟動了感染期幼蟲的發(fā)育和共生細菌的釋放(Cicheetal.，2006)。進行昆蟲病原線蟲人工體外培養(yǎng)時，如果需要通過加入昆蟲血淋巴來誘導(dǎo)線蟲發(fā)育的話，會比較繁瑣，且花費較高。研究發(fā)現(xiàn)，共生細菌也能產(chǎn)生一種信號化合物來誘導(dǎo)線蟲的發(fā)育，但這種信號化合物不穩(wěn)定，因此在向長好共生細菌的培養(yǎng)基中接入感染期幼蟲的時機很重要，以保證獲得高產(chǎn)的齡期一致的感染期幼蟲(Aumann and Ehlers，2001；Johnigketal.，2004)。

共生細菌不僅誘導(dǎo)感染期幼蟲的發(fā)育，還為線蟲的生長提供食物。昆蟲病原線蟲在取食其他屬或者近源種的細菌時會發(fā)育不良，僅取食與之共生的相應(yīng)的共生細菌才能正常發(fā)育，因此有必要在人工培養(yǎng)基上建立并且維持相應(yīng)共生細菌的單菌培養(yǎng)系統(tǒng)。而活體培養(yǎng)時，寄主昆蟲為入侵的線蟲提供了一個無菌的環(huán)境，一旦線蟲釋放共生菌，共生菌就為線蟲在寄主昆蟲血淋巴內(nèi)建立了一個單菌培養(yǎng)系統(tǒng)(Dowds and Peters，2002；Gouge and Snyder，2006)。

建立單菌培養(yǎng)系統(tǒng)首先必須分離昆蟲病原線蟲的共生細菌。共生細菌的分離和純化有兩種方法：一種是從線蟲致死的寄主昆蟲血淋巴內(nèi)分離共生細菌，一種是將感染期幼蟲進行表面消毒后搗爛，從線蟲腸道內(nèi)分離共生細菌。將昆蟲血淋巴或搗爛的線蟲懸液涂布于NBTA培養(yǎng)基(蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，瓊脂粉1.5%，溴百里酚藍0.025%，紅四氮唑0.004%)或MacConkey培養(yǎng)基(胨1.7%，蛋白胨0.3%，乳糖1%，膽鹽0.15%，氯化鈉0.5%，中性紅0.003%，瓊脂粉1.35%)(Akhurst，1980)，根據(jù)形態(tài)和色素挑取單菌再進行純化。共生細菌有兩種型態(tài)，只有初生型(I型)的細胞能夠支持線蟲的生長并被線蟲取食(Han and Ehlers，2001)。進行昆蟲病原線蟲體外培養(yǎng)時，必須確保使用的是初生型的共生細菌，這可以通過NBTA培養(yǎng)基或者MacConkey培養(yǎng)基來鑒別。共生細菌種質(zhì)可以保存于15%甘油中，置于-80℃的超低溫冰箱內(nèi)長期保存。

獲得無菌線蟲的方法有兩種。第一種是用1%次氯酸鈉消毒感染期幼蟲后，接種到長好共生細菌的培養(yǎng)基中。這種方法并不總能得到表面無菌的線蟲，因為表面消毒有時不能殺死感染期幼蟲體表的所有細菌，且容易被真菌污染。第二種方法是消毒線蟲的卵：在Ringer’s溶液(0.9% NaCl，0.042% KCl，0.048% CaCl2和0.02% NaHCO3)中將懷卵的大母蟲(斯氏屬線蟲)或者雌雄同體的異小桿線蟲搗爛，過濾收集卵，使用消毒液(2.5 mL4 M NaOH，0.5 mL 12% NaOCl和21.5 mL無菌水)表面消毒5 min后清洗，收集卵于LB溶液中孵育到1齡(約2 d)，若無細菌污染，則可以將幼蟲接種到長好共生細菌的油脂培養(yǎng)基中(1.6% 營養(yǎng)肉湯，1.2% 瓊脂粉和1%玉米油)，在瓊脂上建立單菌培養(yǎng)系統(tǒng)。瓊脂平板上的單菌線蟲可直接用于線蟲固體或液體的單菌大量培養(yǎng)(Shapiro-Ilanetal.，2014b)。

2.1 固體培養(yǎng)

Glaser(1940)最早用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲用于生物防治，當時共生細菌尚未被認識，線蟲僅僅使用狗糧來培養(yǎng)?，F(xiàn)代的固體培養(yǎng)是建立在單菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將感染期幼蟲接種到相應(yīng)的共生細菌的純培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。昆蟲病原線蟲的固體培養(yǎng)包括4個步驟：培養(yǎng)基準備、共生細菌的培養(yǎng)和接種、線蟲接種及收獲。

2.1.1 固體培養(yǎng)技術(shù)

最早用于昆蟲病原線蟲固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基是瓊脂培養(yǎng)基(Houseetal.，1965；Wouts，1981；Dunphy and Webster，1989)，目前使用最多的是將營養(yǎng)物質(zhì)與海綿混配的三維培養(yǎng)基來進行昆蟲病原線蟲的大量培養(yǎng)，該種培養(yǎng)基是由Bedding(1981，1984)最早發(fā)明的。Bedding的培養(yǎng)基是將打碎的海綿塊與家禽的內(nèi)臟勻漿混配，由于內(nèi)臟質(zhì)量控制難以標準化，容易導(dǎo)致不可預(yù)期的結(jié)果。因此Wouts(1981)發(fā)明了一種用酵母、玉米油、玉米粉和干蛋黃混配的培養(yǎng)基。目前比較通用的改良的海綿培養(yǎng)基配方如下：豆粉15%，面粉5%，玉米油5%，酵母粉1%，蛋黃粉1%，海綿碎10%(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)，此配方由廣東省昆蟲研究所發(fā)明，目前已將該固體培養(yǎng)技術(shù)輻射到朝鮮、巴基斯坦、印度尼西亞、盧旺達等發(fā)展中國家。用于盛裝培養(yǎng)基的容器可以是三角瓶、鐵盒或者塑料袋(Beddingetal.，1991；Gaugler and Han，2002)，但必須保證通氣。培養(yǎng)基的成分和配比會影響感染期幼蟲的產(chǎn)量，需要根據(jù)不同品系的昆蟲病原線蟲對其最適合的培養(yǎng)基進行優(yōu)化。培養(yǎng)基成分中的脂質(zhì)含量、水分、酵母粉、蛋黃、豬油、豆粉、鹽和蛋白質(zhì)含量等均會對感染期幼蟲的產(chǎn)量產(chǎn)生影響(Dunphy and Webster，1989；Hanetal.，1992；Ehlers and Shapiro-Ilan，2005；Salma and Shahina，2012；Shapiro-Ilanetal.，2014a)。

共生細菌可以用LB培養(yǎng)液(氯化鈉0.5%，胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%)或者YS培養(yǎng)液(磷酸氫銨0.05%，磷酸氫鉀0.05%，7水合硫酸鎂0.02%，氯化鈉0.5%，酵母粉0.5%)進行大量培養(yǎng)(Hirao and Ehlers，2009)。新鮮培養(yǎng)的共生細菌接到海綿培養(yǎng)基中，1-4 d后才能接種線蟲，因為共生細菌需要時間將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成適合線蟲發(fā)育和繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)(Forstetal.，2002)。共生細菌的接種量對線蟲產(chǎn)量的影響不大(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)。

在瓊脂培養(yǎng)基上建立的單菌培養(yǎng)物可以直接接種到長好共生細菌的海綿培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。接種單菌線蟲到海綿培養(yǎng)基中必須在無菌環(huán)境中操作，可以直接將長好感染期幼蟲的海綿倒入培養(yǎng)基中(使用三角瓶容器)，或者將線蟲從海綿培養(yǎng)基中洗出后接種到培養(yǎng)基中(適合鐵盆或塑料袋培養(yǎng))。線蟲的接種量會影響一些線蟲品系的產(chǎn)量，比如S.carpocapsaeAgriotos線蟲的最佳產(chǎn)量是在2000 IJ/g的接種量(Hanetal.，1993)，而S.carpocapsaeCB2B和H.bacteriophoraH06的產(chǎn)量則不受接種量的影響(Hanetal.，1992)。增大接種量可以加速線蟲的增殖從而縮短培養(yǎng)時間。

線蟲在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5周后，可以進行收獲(Bedding，1981；Bedding，1984)。收集線蟲時，將培養(yǎng)基收集在紗網(wǎng)做的袋子中，用洗衣機將線蟲洗出，收集洗液后沉淀收集線蟲，清洗2次以上以去除雜質(zhì)，最后用濾布收集線蟲泥(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。線蟲泥中的雜質(zhì)如果不通過清洗盡量去除，容易引起真菌或細菌的污染。

2.1.2 影響因素

昆蟲病原線蟲體外固體培養(yǎng)時，感染期幼蟲的產(chǎn)量在不同的昆蟲病原線蟲品種和品系間會有差異，主要是由線蟲本身的繁殖能力和體長決定的。在相同的培養(yǎng)條件下，H.indicaLN2線蟲的產(chǎn)量可達9.3×105IJ/g培養(yǎng)基，產(chǎn)量遠高于H.bacteriophoraH06線蟲(5.1×105IJ/g 培養(yǎng)基)(Shapiro-Ilanetal.，2014b)。

培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間也是重要的參數(shù)。獲得最大產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)溫度存在種間及品系間的差異。比如S.carpocapsaeCB2B線蟲的最佳培養(yǎng)溫度是27℃，H.bacteriophoraH06線蟲的最佳培養(yǎng)溫度則為25℃，而H.bacteriophora(=heliothidis)線蟲在含脂的瓊脂培養(yǎng)基上的最佳生長溫度為30℃(Hanetal.，1992)。Salma and Shahina(2012)在培養(yǎng)不同品種的巴基斯坦線蟲時發(fā)現(xiàn)，大部分品種在32℃±2℃時可獲得最大產(chǎn)量，而S.feltiae則在20℃±2℃時獲得最大產(chǎn)量。一般情況下，延長培養(yǎng)時間可以獲得更高的產(chǎn)量，但線蟲的死亡率也會隨時間的延長而增加(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)。

2.1.3 優(yōu)缺點

昆蟲病原線蟲的固體培養(yǎng)要求勞力高，因此在人工成本低的發(fā)展中國家應(yīng)用該培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)昆蟲病原線蟲比液體培養(yǎng)更加合適(Ehlersetal.，2000)。固體培養(yǎng)具有共生細菌型變的影響小、技術(shù)要求低、資本投入低、規(guī)模小時失敗的風(fēng)險較低等優(yōu)點。但是當進行大量培養(yǎng)時，上下游操作容易污染，線蟲在培養(yǎng)基中分布不均，不好取樣(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。固體培養(yǎng)時培養(yǎng)基高度不能超過20 cm，否則容器底部會因為缺氧而導(dǎo)致線蟲無法生長。此外，固體培養(yǎng)的穩(wěn)定性不高，培養(yǎng)時間較長，生產(chǎn)效率低于液體培養(yǎng)。

2.2 液體培養(yǎng)

Glaser(1940)最早用基于腎臟的液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)無菌的S.glaseri。當意識到共生細菌在昆蟲病原線蟲培養(yǎng)中的重要性后，單菌培養(yǎng)系統(tǒng)隨之發(fā)展起來。Friedmanetal.(1989)建立了一種基于豆粉、酵母粉、玉米油和蛋黃的培養(yǎng)基，生產(chǎn)的S.carpocapsae產(chǎn)量可達1.1×105IJ/ml。隨后，一系列優(yōu)化的培養(yǎng)基被用于昆蟲病原線蟲的液體培養(yǎng)，而脂類物質(zhì)對昆蟲病原線蟲在液體培養(yǎng)基中生長的重要作用也被逐漸意識到。目前用于昆蟲病原線蟲液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基一般須含有碳源(葡萄糖或甘油)，多種動植物源蛋白，酵母粉及動植物源脂類(Gaugler and Han，2002)。

2.2.1 液體培養(yǎng)技術(shù)

液體培養(yǎng)使用的是生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐)，發(fā)酵罐上有多個探頭檢測各種理化參數(shù)并對溫度、pH和溶氧等參數(shù)進行監(jiān)控。各種參數(shù)中，通氣速率(每分鐘通入液體中的無菌空氣)和攪拌速率是用來控制溶氧的，pH不調(diào)控，僅通過檢測pH值以確定共生細菌代謝活性的變化。液體培養(yǎng)的過程如下：首先是將指數(shù)生長期的共生細菌純培養(yǎng)液以0.01%-0.1%的體積比接種到合適的無菌液體培養(yǎng)基中。當共生細菌生長到顯示典型的代謝變化時(通常以耗氧量dissolved oxygen和pH值的突然改變?yōu)橹笜?可以接種線蟲。幾天后線蟲發(fā)育成成蟲，開始產(chǎn)生后代。通常從開始培養(yǎng)算起，3周后即可收集感染期幼蟲，有些線蟲品種則在2周左右就能獲得最大產(chǎn)量(Shapiro-Ilanetal.，2014b )。培養(yǎng)好的感染期幼蟲可以通過發(fā)酵罐底部的排出閥進行收集、濃縮并配制劑型。

2.2.2 影響因素

感染期幼蟲的恢復(fù)是液體培養(yǎng)流程中的關(guān)鍵。如果恢復(fù)率低，第1代成蟲數(shù)量少，僅有少部分的共生細菌被取食，則第1代成蟲的后代會因為營養(yǎng)充足不能發(fā)育成感染期幼蟲，而形成成蟲。由于此時培養(yǎng)液中的共生細菌質(zhì)量較差，第2代成蟲難以產(chǎn)生后代，所以這個具有兩代成蟲的培養(yǎng)過程中的感染期幼蟲產(chǎn)量會比僅有一代成蟲的培養(yǎng)過程中的感染期幼蟲產(chǎn)量低(Hirao and Ehlers，2010)。培養(yǎng)時間長，收獲時培養(yǎng)液中有高比例的其他齡期的線蟲，會縮短最終線蟲產(chǎn)品的貨架時間。液體培養(yǎng)Heterorhabditis線蟲時，低恢復(fù)率的影響更為嚴重，因為第1代的雌雄同體成蟲是在液體培養(yǎng)基中唯一能夠產(chǎn)生后代的蟲齡，第2代的雄蟲與雌蟲在液體培養(yǎng)環(huán)境中會因無法交配而死亡。因此必須控制培養(yǎng)系統(tǒng)，以確保后代來自于第1代的雌雄同體成蟲，這就必須引導(dǎo)感染期幼蟲恢復(fù)一致并發(fā)育成雌雄同體成蟲，消耗盡培養(yǎng)液中的共生細菌，促使形成一致的感染期幼蟲(Johnigketal.，2004)。雌雄同體成蟲僅釋放一小部分的卵到培養(yǎng)液中，其他卵在母活體孵育并取食卵和母體組織，稱為弒母現(xiàn)象(Endotokia matricida)(Johnigk and Ehlers，1999)。在成功的培養(yǎng)系統(tǒng)中，由于沒有足夠的細菌和營養(yǎng)供給孵化的一齡幼蟲，很容易形成感染期幼蟲，因此大約在加入感染期幼蟲后的10 d即可收獲新的感染期幼蟲。對Steinernema線蟲來說，由于雌雄蟲能夠在流動的液體中交配，可以耐受液體培養(yǎng)基中的水流及剪切力(Strauchetal.，1994)，產(chǎn)生后代不受影響。

液體培養(yǎng)擴大化的主要瓶頸是共生細菌的質(zhì)量，要求能夠觸發(fā)感染期幼蟲的恢復(fù)和發(fā)育，并且為線蟲提供合適的營養(yǎng)以確保線蟲發(fā)育一致，從而在培養(yǎng)的最后步驟獲得純的感染期幼蟲懸液。共生細菌的型變會影響線蟲在液體培養(yǎng)中的產(chǎn)量，次生型共生細菌不能觸發(fā)線蟲的恢復(fù)(Han and Ehlers，2001; Hirao and Ehlers，2009)。滲透壓、熱激以及低氧會導(dǎo)致型變(Krasomil-Osterfeld，1994，1995)。為避免型變，共生細菌必須在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，避免擴大培養(yǎng)過程中含氧量的變化。接種線蟲之前，必須確保細菌生長到穩(wěn)定后期。為獲得最大的線蟲產(chǎn)量，共生細菌的密度必須保證足夠高。共生細菌密度低時，S.feltiae和S.carpocapsae的恢復(fù)率低(Hirao and Ehlers，2009)。如果第一代成蟲取食共生細菌的濃度太低，則大比例的第1代會發(fā)育成成蟲產(chǎn)生第2代，導(dǎo)致沒有足夠的共生細菌支持后代的產(chǎn)生。

液體培養(yǎng)過程中的各種參數(shù)可以進行優(yōu)化以提高生產(chǎn)的質(zhì)量和效率，包括培養(yǎng)基和生物反應(yīng)動力學(xué)的優(yōu)化(Chavarria-Hernandezetal.，2006;2010)，改善接種量及共生細菌密度(Hirao and Ehlers，2010)，確定最佳接種時間(Johnigketal.，2004)，篩選昆蟲病原線蟲具有優(yōu)良性狀的品系(Mukukaetal.，2010；Anbesseetal.，2013)以及優(yōu)化下游的處理等(Youngetal.，2002)。除了溶氧、pH值和溫度外，接種線蟲的時間和濃度等次要參數(shù)也可以進行優(yōu)化。Johnigk and Ehlers(1999)發(fā)現(xiàn)接種線蟲的時機對感染期幼蟲的恢復(fù)率有顯著的影響，培養(yǎng)H.bacteriophora線蟲時，可在共生細菌預(yù)培養(yǎng)過程中pH值最小時加入線蟲，使其恢復(fù)并取食共生細菌。線蟲的恢復(fù)依賴于培養(yǎng)基中二氧化碳的濃度，可以通過降低通氣和增加罐壓來提高二氧化碳的濃度(Jessenetal.，2000)。

2.2.3 優(yōu)缺點

液體培養(yǎng)的最大優(yōu)點是規(guī)模經(jīng)濟，在大規(guī)模生產(chǎn)時勞動力消耗低，易于實現(xiàn)過程控制，保證產(chǎn)品質(zhì)量，方便清洗以及節(jié)省培養(yǎng)空間等(朱明軍等，1999)。液體培養(yǎng)的穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)時間相對較短，生產(chǎn)效率高。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)單位可以從幾毫升擴大到幾個平方米，不用增加額外的勞力。但是前期的資本投入高，對技術(shù)要求也較高，培養(yǎng)過程比較容易受污染的影響(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。但是，對Heterorhabditis線蟲來說，種質(zhì)退化可以通過在液體培養(yǎng)來避免，因為在液體培養(yǎng)時，線蟲不能交配，因此在最終的培養(yǎng)液中包含了純合的近交系。有研究表明，液體單菌培養(yǎng)的線蟲的毒力高于在活體培養(yǎng)(Anbesseetal.，2013)。

3 小結(jié)

昆蟲病原線蟲產(chǎn)品的質(zhì)量必須通過標準的生產(chǎn)流程來保證，因此，昆蟲病原線蟲在培養(yǎng)時必須使用統(tǒng)一的種質(zhì)培養(yǎng)物。共生細菌可以于-80℃ 或者凍干保存幾十年仍可用于生產(chǎn)，但是確保穩(wěn)定的線蟲種質(zhì)則不容易。少量的線蟲可以保存于液氮中，以避免遺傳退化(Wang and Grewal，2002)。商業(yè)化生產(chǎn)時，遺傳變異可以通過在目標昆蟲中繁殖昆蟲病原線蟲再制備無菌線蟲來避免。

昆蟲病原線蟲在生物防治方面的應(yīng)用離不開高效的大量培養(yǎng)的技術(shù)。過去30年間，液體培養(yǎng)的規(guī)模擴大已經(jīng)使成本降低了75%以上，并且將繼續(xù)降低。因此，昆蟲病原線蟲也能應(yīng)用到低價值的作物比如玉米上，而且在歐洲玉米種植地應(yīng)用昆蟲病原線蟲，其價格和效率可以與化學(xué)農(nóng)藥相比(Toepferetal.，2009)。昆蟲病原線蟲應(yīng)用的另一個重要前提是其作為植物保護試劑在許多國家豁免注冊，因此線蟲生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)多元化且有多種生產(chǎn)技術(shù)共存，這些共存的技術(shù)有利于促進技術(shù)的創(chuàng)新和可持續(xù)發(fā)展。根據(jù)不同的需求使用不同的技術(shù)進行培養(yǎng)及生產(chǎn)，可以克服不同培養(yǎng)技術(shù)的局限性，以培養(yǎng)所需要的不同品種的昆蟲病原線蟲，拓展昆蟲病原線蟲的應(yīng)用。

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Production technology of the bio-insecticides: Entomopathogenic nematodes

YAN Xun，HAN Ri-Chou*

(Guangdong Key Laboratory of Integrated Pest Management in Agriculture & Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization，Guangdong Institute of Applied Biological Resources，Guangzhou 510260，China)

Entomopathogenic nematodes are biological control agents that can be used to effectively control boring and subterranean insect pests. Mass production is a prerequisite for the successful commercialisation of entomopathogenic nematodes. The different production techniques, includinginvivoandinvitromethods, are described in the present paper. The application of the production techniques is the basis of nematode stock preservation and mass production, which will explore the industrial production and commercialisation of entomopathogenic nematodes.

Entomopathogenic nematodes；mass production；invivoculture；invitrosolid culture；invitroliquid culture

廣東省省級科技計劃項目(2014A020208075,2016A020210076)；廣東省科學(xué)院廣州市珠江科技新星專項(2013J2200090)；廣東省科學(xué)院項目(2016GDASPT-0305，rcjj201201)

顏珣，女，1980年生，廣東省汕頭人，博士，副研究員，主要從事昆蟲病原線蟲及其應(yīng)用研究，E-mail: yanxun@giabr.gd.cn

*通訊作者Authors for correspondence，E-mail: hanrc@giabr.gd.cn

Received：2015-11-03；接受日期Accepted：2016-02-27

Q965；S476

A

1674-0858(2016)05-1044-08