李子芳+吳錫冬
摘 要:針對干旱脅迫對植物丙二醛和蛋白質(zhì)含量的影響試驗進行了試驗設(shè)計,初步得出了一套可行的方案,并從試驗步驟、試驗項目的特色或創(chuàng)新、試驗可行性分析等幾個方面進行了詳細論述,以便統(tǒng)籌試驗并為學(xué)生的具體操作提供理論指導(dǎo)。
關(guān)鍵詞:試驗設(shè)計方案;丙二醛;蛋白質(zhì)
中圖分類號:Q94-3 文獻標(biāo)識碼:A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.011
Abstract: The experimental design was carried out for measuring the effect of drought stress on the content of malondialdehyde and protein of plants. A feasible rough plan was made. It discussed the procedure, item feature, and feasibility analysis of the experiment. Therefore, the overall experiment was ready for the concrete details.
Key words: experimental design scheme; malondialdehyde; protein
干旱脅迫可使植物脫水,并破壞細胞膜結(jié)構(gòu),形成膜脂過氧化。通過測定丙二醛(MDA)含量可了解膜脂過氧化的程度,間接反映膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。
傳統(tǒng)檢測MDA含量試驗測得的數(shù)據(jù),既受學(xué)生動手能力的影響,又受測定方式的局限,因此,很難真實有效。本項目擬采用測定方式嚴(yán)謹(jǐn),在科研中廣泛采用的南京建成試劑盒,使試驗條件更易控制,數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確;針對細胞破碎程度不同,在試驗中引入蛋白質(zhì)含量的測定,排除誤差干擾;使學(xué)生參與從植物脅迫、試劑配制到細胞破碎、反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集等一系列操作過程中,提高學(xué)生參與試驗的整體性。通過這一系列的手段,激發(fā)學(xué)生對試驗的參與熱情,提升科研認(rèn)知度,提高動手能力和創(chuàng)新意識[1-3]。
1 試驗方案設(shè)計
1.1 試驗設(shè)置及樣品數(shù)
本試驗共計6學(xué)時,每4位同學(xué)1組,每組同學(xué)檢測兩種植物的正常及干旱脅迫樣品,每個樣品3次重復(fù)。
1.2 試驗材料的培養(yǎng)與處理
選用吊蘭和穿心蓮兩種較常見的觀葉植物作為試驗材料,以幼莖或分蘗在幾種培養(yǎng)基質(zhì)中進行生根。結(jié)果表明,珍珠巖的吸水力較好,植物生根最多。
植株培養(yǎng)1個月后,將其分為兩類,一類做干旱處理,基質(zhì)含水量保持在10%左右,另一類正常給水作為對照。這兩類植物在培養(yǎng)7~10 d后即可作為試驗對象使用。
1.3 試驗前期準(zhǔn)備及課后調(diào)查
要求學(xué)生仔細閱讀試劑盒說明書,并作好預(yù)習(xí)報告;在試驗前熟悉各種儀器的操作方法,如移液器、渦旋混合器、離心機及分光光度計等,并通過多次練習(xí)達到準(zhǔn)確使用的目的。
學(xué)生自行準(zhǔn)備試驗材料和配制試劑,教師僅進行必要的指導(dǎo)。
課后通過不記名的方式請學(xué)生寫下對該試驗項目的建議和意見,以便于試驗的改進。
1.4 操作步驟
1.4.1 酶液制備 參考文獻[4]的方法,各植株均取用同一部位的老葉作為待測樣品。將各樣品洗凈后,分別稱取0.2 g置于預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨成粉末,再放入2 mL 50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液,轉(zhuǎn)入離心管中在4 ℃、12 000 r·min-1下離心20 min,上清液即為待測酶液。
1.4.2 MDA含量測定 參考文獻[5]的方法,每組樣品取3支一次性試管,按表1取用各試劑并用旋渦混勻器混勻,試管口用保鮮薄膜扎緊,用針頭刺一小孔,在95 ℃水浴鍋中水浴40 min,樣品取出后流水冷卻,然后在4 000 r·min-1下離心10 min。提取上清液,用分光光度計在波長532 nm處測定各管吸光度值。
按下列公式計算組織中MDA含量:
組織中MDA含量(nmol·mg-1蛋白)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol·mL-1)/待測樣本蛋白濃度(mg蛋白/mL蛋白)
1.4.3 蛋白定量測定 參考文獻[6]的方法,每組樣品取3支一次性試管,按表2取用各試劑并混勻,靜置10 min,用分光光度計在波長595 nm處測定各管吸光度值。
按下列公式計算組織中的蛋白含量:
待測樣本蛋白濃度(g·L-1)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.563 g·L-1)
2 試驗結(jié)果
每個試驗小組的測定結(jié)果均重復(fù)性較高,且趨勢一致。
通過各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計及計算表明,干旱脅迫均對吊蘭和穿心蓮兩種植物的丙二醛和蛋白質(zhì)含量造成了影響,其含量均有一定程度的增加。其中,吊蘭的丙二醛含量較穿心蓮低而蛋白質(zhì)含量則較高,說明吊蘭的耐旱品質(zhì)要較穿心蓮為高。
3 試驗方案可行性分析
(1)試驗對象為幾種常見的室內(nèi)觀葉植物,取材方便,樣本量大。預(yù)備試驗已用陶土、珍珠巖、石英砂等物質(zhì)為培養(yǎng)基質(zhì),摸索出了較適宜進行干旱脅迫的方式;并通過不同時間的干旱處理,確定了最佳干旱處理期限。
(2)與項目組成員探討如何合理有序地安排試驗進度。使學(xué)生既能從容操作,不因試驗過于緊張而造成失誤,又不會使試驗安排松散,分散精力。
(3)在試驗過程中,使學(xué)生的樣本取用位置一致,設(shè)立對照和重復(fù),排除試驗誤差。樣品提取充分,能正確測定植物的丙二醛和蛋白質(zhì)含量。
(4)提交試驗的預(yù)習(xí)和試驗報告,完整再現(xiàn)試驗的準(zhǔn)備和測定過程。根據(jù)試驗結(jié)果,分析植物的膜脂過氧化程度。指出試驗中應(yīng)注意的事項,對試驗中存在的潛在問題加以討論。
4 結(jié)論與討論
該試驗方案的特色與創(chuàng)新為:(1)在試驗的每一個過程中都由學(xué)生團隊合作完成,教師僅對學(xué)生進行必要的指導(dǎo);(2)避免了使用如冰乙酸等傷害刺激性試劑,對操作人員無任何毒害,排除了傳統(tǒng)試驗中沸水浴加熱時間不正確的問題;(3)采用綜合試驗設(shè)計方式,將丙二醛含量和細胞破碎程度綜合考量,對兩種植物的膜抗逆性能做出比較,提高了學(xué)生的科研認(rèn)知水平[7-9]。
使用試劑盒來測定植物樣本的丙二醛和蛋白質(zhì)含量,具有比傳統(tǒng)方法更加簡便、快速,靈敏度和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。盡管在基礎(chǔ)理論知識層面和試驗動手操作技能方面,學(xué)生水平會表現(xiàn)出參差不齊[10],但通過學(xué)生課上表現(xiàn)及調(diào)查試驗課后的反饋發(fā)現(xiàn),通過課前的充分準(zhǔn)備和練習(xí),學(xué)生能積極參與試驗并普遍對該試驗認(rèn)同度較高。學(xué)生對精密試驗儀器和高端測定方式感到新奇,因而激發(fā)了對試驗的參與熱情,這不僅提升了科研認(rèn)知度,還在分工協(xié)作的過程中提高了動手能力和創(chuàng)新意識。
回顧試驗過程及學(xué)生反饋,本次試驗項目的設(shè)立是一次積極有益的嘗試,將為以后此類試驗項目的開設(shè)打下良好的基礎(chǔ)。
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