吳天樂， 陳 藝， 馬 力， 曾糧斌， 李良導(dǎo)

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所， 湖南 長沙 410205； 3.湖南女子學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

一株油茶炭疽病病原拮抗細(xì)菌的分離與鑒定

吳天樂1， 陳 藝1， 馬 力1， 曾糧斌2， 李良導(dǎo)3

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所， 湖南 長沙 410205； 3.湖南女子學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

采用梯度稀釋涂板法和平板對峙培養(yǎng)法從油茶林根際土中分離、篩選到了一株對油茶炭疽病原具有拮抗作用的細(xì)菌，編號為YCSF-1，其對油茶炭疽病病原的抑菌圈直徑達20.6 mm。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化測定、16Sr RNA序列比對鑒定，該菌株為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。該研究為油茶炭疽的生物防治提供菌株。

油茶； 炭疽?。?拮抗細(xì)菌； 鑒定

油茶(CamelliaoleiferaAbel)是我國特有的木本油料植物，其與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物。油茶籽油中以油酸為主的不飽和脂肪酸含量高達90%以上，單價不飽和脂肪酸與高價不飽和脂肪酸的比例接近國際公認(rèn)的最佳食用油脂肪酸結(jié)構(gòu)比例(10∶1)。同時，油茶籽油還富含維生素E、角鯊烯和山茶皂苷等功能活性成分，長期食用具有增強人體免疫力、延緩衰老、降低血壓血脂、預(yù)防心腦血管疾病等醫(yī)療保健作用，聯(lián)合國糧農(nóng)組織已將其作為重點推廣的健康型高級食用植物油[1-3]。近年來，油茶產(chǎn)業(yè)受到我國各級政府的高度重視，得到大力推廣，油茶種植面積迅速增加。

油茶炭疽病是由油茶炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起，是油茶主要的病害之一，發(fā)生普遍，能引起嚴(yán)重的落葉、落蕾、落果、枝枯，甚至整株衰亡，可使油茶減產(chǎn)40%～50%，影響油茶品質(zhì)，造成重大的經(jīng)濟損失，制約油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-7]。目前，種植抗性品種和化學(xué)防治是油茶炭疽病防治的主要途徑。但油茶炭疸病侵染源廣，發(fā)生期長(終年都有發(fā)生)，受害部位多，抗炭疽病的油茶品種少，抗性品種的育種周期較長，難以立即滿足油茶種植發(fā)展的需求?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治油茶炭疽病，雖然能在一定程度上快速降低損失，但容易引起油茶炭疽病原抗藥性的產(chǎn)生。大劑量化學(xué)農(nóng)藥的使用不僅嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，同時使得茶油內(nèi)的農(nóng)藥殘留量增加，降低茶油的品質(zhì)，影響油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

近年來，國內(nèi)學(xué)者們開始考慮研究從植物或微生物中開發(fā)對油茶炭疽病有防治作用的綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥[3，8-9]。信珊珊等[10-11]從水稻根部分離到的1株對油茶炭疽病有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌WH1，并鑒定、提取了該拮抗菌中抑菌活性物質(zhì)脂肽。周國英團隊從油茶林不同類型土樣中分離了194株放線菌，篩選出一株對油茶炭疽病有良好拮抗作用的放線菌F10[12-14]；分離到223株細(xì)菌，通過平板對峙培養(yǎng)初步選出抑菌效果較好的菌株21株，其抑菌圈寬度在5.0～12.5 mm，其中菌株Z17和Z26對油茶病害有較好的抑菌效果，具有一定的生防潛力[15]；從健康油茶組織中分離到細(xì)菌菌株156株，篩選出一株對油茶炭疽病有明顯拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌Y13，與油茶炭疽病原平板對峙時抑菌直徑達10 mm，鑒定為枯草芽孢桿菌；開發(fā)的Y13菌劑在林間應(yīng)用，對油茶炭疽病的防效70%以上，與對照藥劑百菌清的防治效果相當(dāng)[16-17]；篩選獲得對油茶炭疽病菌具有較強拮抗作用的真菌3株，編號為C5、S2、H18，PAD平板上對油茶炭疽病菌的抑制率分別為60.7%、60.0%、58.0%[18]；篩選出博落回的3種粗提取物對油茶炭疽病菌、油茶軟腐病菌均有抑制作用，在一定濃度時，對兩種病菌的室內(nèi)離體抑制率分別達80.87%、61.1%[19]。

綜上所述，篩選和利用拮抗微生物成為油茶炭疽病的新型防治技術(shù)。本研究以油茶炭疽病原為研究對象，篩選對油茶炭疽病原具有較好的拮抗作用的細(xì)菌，為油茶炭疽防控提供新的解決途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株 油茶炭疽病病原由中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室菌種保存中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)以及發(fā)酵種子液的制備；PDA 培養(yǎng)基用于拮抗菌的篩選。

1.1.3 細(xì)菌鑒定的主要試劑和儀器 細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA maker、dNTP、DNA聚合酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；其余均為國產(chǎn)分析純。電泳儀購自北京六一儀器廠，PCR儀購自美國ABI公司，恒溫?fù)u床購自天津歐諾儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離及篩選 拮抗細(xì)菌的分離：采集湖南省林業(yè)科學(xué)院油茶林的根際土，盡量保持低溫下帶回實驗室4 ℃?zhèn)溆?。采用梯度稀釋涂板法分離拮抗細(xì)菌[20]，取土樣5 g置于45 mL的無菌水中，渦旋震蕩成均勻懸浮液，將懸浮液分別稀釋成10-5、10-6、10-7系列濃度梯度，然后每個濃度梯度分別吸取100 μL均勻涂布至NA 平板上，置于28 ℃下培養(yǎng)，每個濃度重復(fù)3次，36 h后挑選形態(tài)各異的菌落進行劃線純化，編號并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

拮抗細(xì)菌的篩選：采用平板對峙培養(yǎng)法[21]篩選拮抗細(xì)菌，PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)油茶炭疽病菌至滿皿，采用打孔法，將直徑為5 mm的油茶炭疽病菌塊接種于?=9 cm的PDA平板中心，然后將候選細(xì)菌點接至距平板中心2.5 cm處，以不接種細(xì)菌的平板為對照，每個處理重復(fù)3次，平板置于28 ℃下培養(yǎng)，待對照組菌落長滿全皿時，測量每個細(xì)菌的抑菌圈直徑，選出抑菌圈最大即生防潛力最強的目的拮抗細(xì)菌，進行后續(xù)研究。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 將目的拮抗細(xì)菌劃線接種至NA平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長形態(tài)并進行常規(guī)的革蘭氏及芽孢染色。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.4 拮抗細(xì)菌的16Sr RNA基因序列分析 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取目的拮抗細(xì)菌的DNA；利用通用引物B27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細(xì)菌16S rRNA片段；PCR反應(yīng)體系(50 μL)為10× PCR buffer 5 μL，DNA模板 1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 34.5 μL；反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序，將測定的序列在GenBank中進行BLAST相似性比對(available at：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的分離和篩選

從湖南省林業(yè)科學(xué)院油茶林根際土壤中共分離篩選到21株對油茶炭疽菌有拮抗效果的細(xì)菌。其中，編號為YCSF-1的菌株對病菌的拮抗能力最強，抑菌圈最大，直徑達到20.6 mm(見圖 1)。因此，菌株YCSF-1被選用于進一步的研究工作。

圖1 YCSF-1對油茶炭疽菌抑制作用Fig.1 YCSF-1 antagonistic effect on Colletotrichum gloeosporioides of Camellia oleifera

2.2YCSF-1菌株的菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株YCSF-1在NA平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，污白色，不透明，表面光滑(見圖2)；革蘭氏染色呈陽性(見圖3)，為革蘭氏陽性菌；芽孢染色有芽孢生成(見圖4)。

圖2 YCSF-1菌落形態(tài)圖Fig.2 A colony of strain YCSF-1

圖3 YCSF-1革蘭氏染色圖Fig.3 Gram-staining of strain YCSF-1

圖4 YCSF-1芽孢染色圖Fig.4 Spore staining of strain YCSF-1

2.2.2 生理生化特征 由表1可知，YCSF-1菌株能利用半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖；葡萄糖發(fā)酵、接觸酶測定、氧化酶測定、明膠液化測定、硝酸鹽還原測定、卵磷脂酶測定呈陽性；能利用丙二酸鹽、檸檬酸鹽；VP實驗呈陽性，甲基紅MR測定呈陰性，能分解纖維素，不水解淀粉。初步鑒定為芽孢屬。

2.2.3 16S rRNA分子鑒定 以菌株YCSF-1基因組DNA為模板，利用16S rRNA細(xì)菌通用引物進行PCR擴增和測序，獲得的16S rRNA基因的片段長度為1 452 bp，從GenBank中調(diào)取芽孢屬不同種的 12株標(biāo)準(zhǔn)菌株的 16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示(見圖5)菌株YCSF-1與側(cè)孢短芽孢(Brevibacillus_laterosporu_(T)_IAM_12465_D16271)的同源關(guān)系最近，序列相似性達到99%。綜合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株YCSF-1為Brevibacilluslaterosporu(或Bacil-lus laterosporuss)中文名稱側(cè)孢短芽孢桿菌。

表1 YCSF-1生理生化特征Tab.1 PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofYCSF-1表性特征反應(yīng)特征表性特征反應(yīng)特征接觸酶測定+檸檬酸鹽利用+氧化酶測定+卵磷脂酶活性測定+淀粉水解測定-丙二酸鹽利用+甲基紅MR測定-纖維素分解+VP實驗+半乳糖利用+明膠液化測定+阿拉伯糖利用+硝酸鹽還原測定+甘露糖利用+葡萄糖發(fā)酵+D-果糖利用+產(chǎn)硫化氫測定-D-木糖利用+ 注:“+”代表反應(yīng)為陽性,“-”代表反應(yīng)為陰性。

圖5 YCSF-1 16Sr RNA比對結(jié)果Fig.5 YCSF-1 16Sr RNA sequence alignment result

3 結(jié)論與討論

微生物介導(dǎo)的生物防治由于其對環(huán)境的友好性而成為備受人們青睞的可持續(xù)發(fā)展的一種防控病害的方法。土壤是微生物的天然培養(yǎng)基，生存著許多具有復(fù)雜相互作用的微生物，它們共同構(gòu)成了無比豐富的菌種資源庫，根際的微環(huán)境中存在大量活性很高、能夠影響病原菌的生存或侵染的微生物種群，是人們獲得有益微生物的一個重要來源[22]。

側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporu)自被發(fā)現(xiàn)以來便受到國內(nèi)外研究者的興趣，它具有殺蟲、抗菌、抗腫瘤、生物降解轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)活性，在生物防治、環(huán)境保護、醫(yī)學(xué)、微生物菌劑開發(fā)等諸多方面顯示了巨大的應(yīng)用價值和潛力。對多種植物病原真菌如立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、楊樹爛皮病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果輪紋病菌等有廣譜抗性。該菌可以從土壤中獲得。趙秀香等[23]從煙草根際土壤中，分離到一株生防菌側(cè)孢短芽孢桿菌B8，其發(fā)酵液對煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)顯示了較強的抑制作用。SONG Z.等[24]從蘋果根際中分離到側(cè)孢短芽孢桿菌ZQ2，能產(chǎn)生廣譜抗性的抑真菌活性物質(zhì)。陳潺等[25]從山東泰安各種類型土壤中分離得到編號為AMCC 100017側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)，平板對峙試驗結(jié)果表明該菌株對多種植物病原真菌均有較強的拮抗作用。

本文采用梯度稀釋涂板法和平板對峙培養(yǎng)法從油茶林根際土壤中共分離篩選到21株對油茶炭疽菌有拮抗效果的細(xì)菌。其中，編號為YCSF-1的菌株對病菌的拮抗能力最強，對油茶炭疽病原的抑菌圈直徑達到20.6 mm，抑菌圈直徑大于以前研究者所篩選的拮抗菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化測定、16S rRNA序列比對鑒定，該菌株為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporu)。YCSF-1菌株對油茶炭疽病具有一定的生防潛力，可作為防治油茶炭疽病的優(yōu)良微生物資源，用于開發(fā)環(huán)境相容性好的微生物生防菌劑。本文只是前期研究，關(guān)于YCSF-1對油茶炭菌病的大田防控實驗、防治機理、有效抑菌物質(zhì)的分析、抑菌劑的制備等相關(guān)研究還有待開展。

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IsolationandidentificationofanantagonisticbacteriatoColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera

WU Tianle1， CHEN Yi1， MA Li1， ZENG Liangbin2， LI Liangdao3

(1.Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China；2.Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China；3.Hunan Women′s University， Changsha 410004， China)

A strain of bacteria was isolated from the rhizosphere soil ofCamelliaoleiferausing plate dilution method and plate confrontation culture method，which had antagonistic effect on ColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera.The diameter of the inhibition zone was 20.6mm.After morphological and 16Sr RNA sequence alignment，this strain was identified asBrevibacilluslaterosporus.The research provided the strains for the biological control ofColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera.

Camelliaoleifera；Colletotrichumgloeosporioides； antagonistic bacteria；identification

2016-07-27

國家林木種質(zhì)資源平臺建設(shè)(2016DKA210003)。

S 763.7

A

1003-5710(2016)05-0062-05

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 012

(文字編校：張 珉)