江　毅　楊佰雨　孔維歡　王大軍　趙月龍　劉盼召　冉大鵬　趙浩　周劉濤　何　雷

(河南科技太學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南洛陽(yáng)　471003)

TGEV-PEDV二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

江毅楊佰雨孔維歡王大軍趙月龍劉盼召冉大鵬趙浩周劉濤何雷*

(河南科技太學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南洛陽(yáng)471003)

本試驗(yàn)旨在建立能同時(shí)檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的二重RT-PCR檢測(cè)方法.首先根據(jù)GenBank收錄的TGEV和PEDV的基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的特異性引物,然后通過(guò)優(yōu)化二重PCR的體系建立一個(gè)二重RT-PCR檢測(cè)方法.用該方法對(duì)臨床收集的10份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特異性和靈敏度,能用于臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

豬傳染性胃腸炎病毒豬流行性腹瀉病毒多重PCR診斷

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材病毒與病料

豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)細(xì)胞分離毒株和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)病料以及采集的疑似病毒性腹瀉糞便樣品.由河南科技大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2單項(xiàng)PCR擴(kuò)增cDNA

取200uL病毒液樣品按照病毒RNA提取試劑盒分別提取TGEV和PEDV的病毒RNA.進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),退火溫度分別為(PEDV 55℃,TGEV 57℃),引物序列為.隨后將目的片段進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3多重PCR的建立

在單對(duì)引物擴(kuò)增成功的基礎(chǔ)上,將目的片段加入同一PCR反應(yīng)體系中配制二重PCR反應(yīng)混合液.退火溫度分別為57℃.同時(shí),對(duì)多重PCR反應(yīng)體系的引物濃度、退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化。

1.4特異性試驗(yàn)

參照2.2方法分別對(duì)PRRSV、CSFV、PCV等,進(jìn)行RNA和DNA的提取,以該系統(tǒng)所建立的PCR體系和引物通過(guò)RT-PCR和PCR擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)PEDV和TGEV細(xì)胞毒混合物為陽(yáng)性對(duì)照,以檢驗(yàn)該方法的特異性。

19周齡4個(gè)處理組雞體重和脛長(zhǎng)見(jiàn)表4。由表4可以看出，育成期不同的蛋白質(zhì)水平對(duì)雞體重和脛長(zhǎng)造成的影響，在統(tǒng)一日糧后，飼喂5周，即蛋雞在19周齡時(shí)各處理的體重和脛長(zhǎng)已無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

1.5敏感性試驗(yàn)

將TGEV和PEDV細(xì)胞毒株混合物為陽(yáng)性對(duì)照.調(diào)整核酸濃度,按l0倍以?xún)?nèi)的濃度梯度稀釋,按優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6多重PCR方法的臨床應(yīng)用

取本實(shí)驗(yàn)室所采集的疑似病毒性腹瀉糞便為樣品,按照上述方法建立的多重PCR技術(shù),檢測(cè)TGEV和PEDV。

2　結(jié)果與分析

2.1TGEV-PEDV二重PCR檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化

首先本研究通過(guò)對(duì)病料組織的RNA的提取,并通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增了PEDV和TGEV基因片段.在上述研究的基礎(chǔ)上,本研究以TGEV和PEDV的回收產(chǎn)物為模板,設(shè)計(jì)TGEV和PEDV特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)展(圖2),電泳結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期目的片段,對(duì)其優(yōu)化結(jié)果表明,最佳退火溫度為57℃。

圖1　TGEV-PEDV二重PCR凝膠電泳圖

圖2　TGEV-PEDV多重PCR的特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)PRRSV、CSFV、PCV等進(jìn)行了RNA和DNA的提取,以該系統(tǒng)所建立的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增,特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該P(yáng)CR體系對(duì)PRRSV、CSFV、PCV均無(wú)擴(kuò)增(圖3),說(shuō)明所建立的PCR體系特異性強(qiáng)。

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將目的片段的核酸分別作稀釋,使其濃度分別為100ng、50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng和0.1ng的總量,并以此作為擴(kuò)增模板,結(jié)果表明,核酸量為100ng,50ng,10ng和5ng和1ng能擴(kuò)增出特異性條帶,而PEDV和TGEV的核酸為0.5ng的僅能擴(kuò)增微弱的條帶;的沒(méi)有擴(kuò)增條帶.因此該P(yáng)CR體系的靈敏性為0.1ng/uL。

2.4多重PCR臨床檢測(cè)初步應(yīng)用

以建立的二重PCR方法檢測(cè)采集的臨床8份樣品進(jìn)行了檢測(cè),見(jiàn)圖3,結(jié)果表明3份為PEDV陽(yáng)性,2份為T(mén)GEV陽(yáng)性,沒(méi)有檢測(cè)到混合感染的病例。

圖3　多重PCR臨床初步應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

3　討論

豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒感染是仔豬的常見(jiàn)疾病,發(fā)病率高,目前均沒(méi)有有效的藥物,且兩者在臨床癥狀、流行病學(xué)和病理變化上無(wú)明顯差異.嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展.臨床上此兩種病往往混合感染.RT-PCR技術(shù)目前是鑒別診斷上述病毒病原的最敏感、特異的方法。

多重PCR技術(shù)在同一體系中實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)基因的特異性擴(kuò)增,但并非單一PCR簡(jiǎn)單混合.引物設(shè)計(jì)是其中一個(gè)關(guān)鍵因素.除了考慮每對(duì)引物的特異性及擴(kuò)增效率之外.還必須盡量減少引物對(duì)之間形成二聚體的可能,此外,還須對(duì)各對(duì)引物濃度配比、退火溫度及其他PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.相對(duì)于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)單一病原體,多重PCR能同時(shí)進(jìn)行多種病原微生物的鑒定,且具有靈敏、快捷等特點(diǎn),適于大規(guī)模檢測(cè),在動(dòng)物疫病的流行病學(xué)的調(diào)查與預(yù)防中,具有不可替代的作用.本文針對(duì)TGEV和PEDV基因序列,擴(kuò)增了2個(gè)特異性片段,長(zhǎng)度分別為500bp和750bp目的片段之間具有明顯的長(zhǎng)度差異,便于鑒別,且單對(duì)引物的擴(kuò)增特異性強(qiáng),擴(kuò)增效率高,為在獸醫(yī)臨床中PEDV和TGEV的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了技術(shù)手段。

河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)基金(SY1314047)和大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(SRTP)項(xiàng)目(2014265)支持。

江毅(1995-),男,河南洛陽(yáng)人,本科學(xué)歷,主要研究方向:分子病原學(xué)和免疫學(xué)。

何雷(1983-),男,河南南陽(yáng)人,博士學(xué)歷,講師,研究方向:分子病原學(xué)和免疫學(xué)。