馬士博，譚　飛，姜艷平，喬薪瑗，崔　文，唐麗杰，劉　敏，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬輪狀病毒HeBei-12株在MA-104細(xì)胞上最適繁殖時(shí)間的摸索

馬士博，譚飛，姜艷平，喬薪瑗，崔文，唐麗杰，劉敏，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

本試驗(yàn)將HeBei-12株豬輪狀病毒在MA-104細(xì)胞上培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行核酸提取及RT-PCR檢測(cè)證明，該病毒可以很好的適應(yīng)細(xì)胞。為獲得最佳的病毒培養(yǎng)量，本試驗(yàn)分別從間接免疫熒光，增殖動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)以及病毒感染細(xì)胞后的超薄切片電鏡對(duì)病毒的繁殖周期做了初步研究。結(jié)果表明，HeBei-12株豬輪狀病毒在感染MA-104細(xì)胞時(shí)，病毒粒子是隨著時(shí)間的變化而變化的，當(dāng)病毒接種20 h時(shí)即可在細(xì)胞質(zhì)中觀(guān)察到病毒粒子。當(dāng)病毒感染細(xì)胞64 h時(shí)，滴度達(dá)到最大值4.8 logTCID50/mL，此后滴度逐漸下降。本試驗(yàn)對(duì)豬輪狀病毒地方流行株HeBei-12株在MA-104細(xì)胞上的最佳繁殖時(shí)間進(jìn)行摸索，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性和疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

豬輪狀病毒HeBei-12株；繁殖時(shí)間；恒河猴胎腎細(xì)胞

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉的重要病原之一，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其發(fā)生不受衛(wèi)生狀況影響，由于目前尚無(wú)特效藥物治療，疫苗接種仍是最有力的預(yù)防和控制措施。因此選擇理想毒株以及摸索最佳病毒繁殖量在研制豬輪狀病毒疫苗是至關(guān)重要的。本研究從不同角度分析了HeBei-12株豬輪狀病毒在MA-104細(xì)胞上的繁殖趨勢(shì)，以期為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性和疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1病料及細(xì)胞豬腹瀉病料（2012年采自河北省某豬場(chǎng)）經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)為豬輪狀病毒陽(yáng)性，命名為HeBei-12株，于-80℃冷藏備用。JL-94株輪狀病毒為本實(shí)驗(yàn)室保存。MA-104細(xì)胞（恒河猴胎腎傳代細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑DMEM、胎牛血清為HyClone公司產(chǎn)品；小量病毒RNA抽提試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0），購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購(gòu)自Sigma公司；豬輪狀病毒陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成參考GenBank中porcine RV（L29186.1）參考株基因序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)合成特異性套式PCR引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列參見(jiàn)表1。

表1　套式PCR引物序列

1.4方法

1.4.1病料處理及細(xì)胞接種將糞便樣品移入EP管中，經(jīng)研磨器充分研磨后，按1∶1比例加入PBS緩沖溶液，將樣品懸起，反復(fù)凍融3次，4 000 r/min（4℃）離心15 min，收集上清。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為輪狀病毒陽(yáng)性且不混合感染其他腹瀉病毒。將腹瀉病料用無(wú)血清的DMEM進(jìn)行1∶10稀釋?zhuān)磸?fù)凍融3次，12 000 r/min離心8 min，取上清用0.22 μm濾器過(guò)濾后，接種于MA-104細(xì)胞，用含10%FBS（新生牛血清）的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。病毒接種前，用30 μg/mL胰酶在37℃處理60 min，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，按0.05 MOI接種HeBei-12株病毒，待CPE達(dá)90%時(shí)收獲病毒液，按此方法將病毒連續(xù)傳代，觀(guān)察細(xì)胞病變［1］。

1.4.2RT-PCR檢測(cè)取病毒在MA-104上得第8代細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清5 000 r/min離心15 min。采用小量病毒RNA抽提試劑盒提取病毒基因組RNA，然后在42℃條件下反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用針對(duì)流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒及輪狀病毒的引物對(duì)其進(jìn)行nest-PCR檢測(cè)［2］。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)30個(gè)，72℃終延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。所得的PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.4.3間接免疫熒光檢測(cè)取第8代輪狀病毒核酸陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)物接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的MA-104細(xì)胞，分別在第36、54、70 h和100 h時(shí)用甲醇固定（4℃，10 min），Triton X-100作用10 min，3% BSA 37℃封閉30 min，依次加入鼠抗輪狀病毒JL-94株全病毒多克隆抗體（1∶200稀釋?zhuān)┖虵ITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋?zhuān)謩e于37℃條件下作用60 min，PBS清洗后分別在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果［3］。

1.4.4增殖動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的繪制取第8代輪狀病毒核酸陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)物接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的MA-104細(xì)胞，每10 h測(cè)其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50），比較病毒滴度的變化情況，具體方法如下：將10倍系列稀釋的病毒接種于長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照和未稀釋病毒對(duì)照。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5 d，每天觀(guān)察細(xì)胞病變。按Reed-Muench公式計(jì)算病毒的感染性滴度［4］。

1.4.5電鏡檢測(cè)將HeBei-12株輪狀病毒接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的MA-104細(xì)胞，每10 h取病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物（90 mL），離心后用1 mL DMEM懸起。4%戊二醛前固定，再用1%OsO4后固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，烘干10 d左右，對(duì)樣品進(jìn)行超薄切片后正染色，最后置于透射電子顯微鏡下觀(guān)察［4-5］。

2　結(jié)果

圖1　輪狀病毒HeBei-12株感染MA-104細(xì)胞70 h時(shí)的CPE （40×）

2.1CPE觀(guān)察豬狀病毒HeBei-12株感染MA-104細(xì)胞70 h時(shí)，可觀(guān)察到明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞膜融合，細(xì)胞核固縮、空泡化，感染細(xì)胞大片脫落，如圖1B。

2.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果通過(guò)對(duì)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物RNA的提取，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，經(jīng)核酸檢測(cè)得到大小約274 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。結(jié)果表明，HeBei-12株輪狀病毒已適應(yīng)MA-104細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3間接免疫熒光檢測(cè)對(duì)輪狀病毒核酸陽(yáng)性者在MA-104細(xì)胞上接種。為獲得病毒在細(xì)胞上的最佳繁殖量，本試驗(yàn)對(duì)收毒時(shí)間進(jìn)行初步摸索，圖3為HeBei-12株病毒在MA-104細(xì)胞上繁殖36、54、70 h和100 h時(shí)的間接免疫熒光結(jié)果（如圖3）。結(jié)果表明，當(dāng)病毒感染36 h時(shí)，細(xì)胞保持著完整的形態(tài)，僅呈現(xiàn)出輕微的熒光（如圖3A和3E）。54 h時(shí)細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生輕微病變，細(xì)胞質(zhì)染色加深且特異性熒光更加明顯（如圖3B和3F）。70 h時(shí)呈現(xiàn)明顯的CPE，有的細(xì)胞完全被熒光顆粒所充滿(mǎn)，有的細(xì)胞已經(jīng)破裂，僅可以看到非特異性的細(xì)胞輪廓（如圖3C和3G）。100 h時(shí)大部分細(xì)胞破裂，喪失細(xì)胞形態(tài)（如圖3D和3H）。由此，初步確定病毒在MA-104細(xì)胞上培養(yǎng)最適培養(yǎng)時(shí)間為60～70 h。

圖3　間接免疫熒光結(jié)果

2.4病毒的動(dòng)力學(xué)增殖曲線(xiàn)將HeBei-12病毒接種于MA-104細(xì)胞，測(cè)定其動(dòng)力學(xué)增殖曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)病毒感染64 h時(shí)，在MA-104細(xì)胞中滴度達(dá)到最大值4.8 log TCID50/mL。此后滴度逐漸下降。因此，確定病毒感染MA-104細(xì)胞的最適收毒時(shí)間為64 h。

圖4　病毒的增殖動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

2.5超薄切片電鏡將HeBei-12株豬輪狀病毒接種于MA-104細(xì)胞，在不同時(shí)間對(duì)病毒量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)病毒感染細(xì)胞20 h時(shí)，細(xì)胞保持完整且良好的形態(tài)，未見(jiàn)有病毒粒子。30 h時(shí)視野中觀(guān)察到了典型的病毒粒子，彌散的存在于細(xì)胞質(zhì)中。40 h時(shí)細(xì)胞質(zhì)中的病毒粒子增多，細(xì)胞發(fā)生輕微的病變。50 h時(shí)病毒粒子繼續(xù)增殖，病變程度加深，細(xì)胞折光度發(fā)生了明顯的變化。60 h時(shí)病毒粒子充滿(mǎn)了整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核明顯萎縮。70 h時(shí)病毒粒子開(kāi)始減少，細(xì)胞核空泡化，各個(gè)細(xì)胞器均發(fā)生了明顯的病變且失去了完整的細(xì)胞構(gòu)架。80 h時(shí)伴隨著病毒粒子的釋放細(xì)胞質(zhì)中的病毒進(jìn)一步減少。病毒繁殖90 h后，細(xì)胞形態(tài)已基本喪失。

圖5　超薄切片

3　討論

輪狀病毒是引起幼齡動(dòng)物腹瀉的重要病原之一。該病發(fā)生于世界各地，給畜牧業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無(wú)特效藥物來(lái)治療該?。?-7］，主要仍以預(yù)防為主，而病毒在細(xì)胞上的分離培養(yǎng)和提高滴度是疫苗研制的關(guān)鍵因素。

本試驗(yàn)對(duì)從河北省收集的豬腹瀉糞便樣品（已經(jīng)驗(yàn)證了其為輪狀病毒感染，且無(wú)其他腹瀉病毒的混合感染），命名為HeBei-12株。對(duì)該病毒在MA-104細(xì)胞上進(jìn)行馴化培養(yǎng)。結(jié)果顯示，該毒株在MA-104細(xì)胞上可出現(xiàn)典型的CPE，且隨著傳代次數(shù)增加，出現(xiàn)CPE的時(shí)間縮短，細(xì)胞病變程度也隨之加劇。證明病毒可很好的適應(yīng)細(xì)胞。

收毒時(shí)間是獲得高滴度病毒的關(guān)鍵因素［8］，一方面病毒在細(xì)胞中有其各自的繁殖周期，另一方面從細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的病毒并不能長(zhǎng)時(shí)間的耐受37℃的條件。所以，當(dāng)各方面因素達(dá)到平衡時(shí)獲得病毒的最高滴度尤為重要。本試驗(yàn)分別從間接免疫熒光試驗(yàn)，增殖動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)以及病毒感染細(xì)胞后的超薄切片電鏡觀(guān)察進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳收毒時(shí)間。結(jié)果顯示，當(dāng)病毒感染64 h時(shí)，病毒滴度可達(dá)到最大值4.8logTCID50/ mL。隨著時(shí)間的推移滴度逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此確定病毒在MA-104細(xì)胞中培養(yǎng)的最佳收毒時(shí)間為64 h。

本試驗(yàn)證明了HeBei-12分離株對(duì)細(xì)胞具有良好的適應(yīng)性，并對(duì)其在細(xì)胞中的繁殖情況進(jìn)行摸索。為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性和疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。

［1］庫(kù)旭鋼，張坤，劉羽茜，等.豬A群輪狀病毒的分離與鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，42（2）：275-281.

［2］鄧俊花，單虎.輪狀病毒套式PCR方法的建立［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，12:89-90.

［3］尹興曉，文喻玲，趙慶歡，等.輪狀病毒Vp6蛋白的免疫熒光檢測(cè)［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008，21（5）：434-437.

［4］林杰，竇強(qiáng)，劉溯，等.輪狀病毒LLR株在兩種不同細(xì)胞中病毒滴度的比較［J］.中國(guó)新藥雜志，2013，22（6）：643-646.

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［6］陳元坤，周小平，周聯(lián).豬輪狀病毒腹瀉病的診斷方法研究［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2011，4：29-33.

［7］陳曉春，吳華偉，張廣川，等.豬輪狀病毒的分離與鑒定［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47（9）：4-8.

［8］Fang，Zhizheng.Rotavirus and vaccine in China.第五次全國(guó)免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編，銀川：2011，8.

Gropefor optimal proliferation timeof porcinerotavirusHeBei-12 strain in MA-104 cell line

MA Shi-bo，TAN Fei，JIANG Yan-ping，QIAO Xin-yuan，CUI Wen，TANG Li-jie，LIU Min，LI Yi-jing
（Department of Preventive Veterinary，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In this study，we showed that rotavirus HeBei-12 strain could grow well on MA-104 cell demonstrated by RT-PCR. Virus propagation was analyzed by immuno-fluorescence，proliferation kinetics，and electron microscope detection，and the haresting time was also optimized.The results showed that the virus particles constantly changed with time.The highest value of 4.8logTCID50/mL was detected at 62 h before the titers decreased gradually.Determination for optimal proliferation time would make a contribution to molecular biology study and vaccine development on porcine rotavirus.

Porcine rotavirus HeBei-12 strain；proliferation；MA-104 cell line

LI Yi-jing

S852.65+9.4

A

0529-6005（2016）04-0026-04

2014-11-04

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012AA10-1304-3）

馬士博（1989-），女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物與免疫，E-mail：mashibo8904@126.com

李一經(jīng)，E-mail：yijingli@163.com