林標(biāo)聲，吳江文，戴愛玲，楊小燕

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；

2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012）

銀杏葉-桑葉中藥發(fā)酵制劑防治仔豬病毒性胃腸炎的應(yīng)用效果研究

林標(biāo)聲1，2，吳江文1，戴愛玲1，2，楊小燕1，2

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；

2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012）

為了研究中藥發(fā)酵制劑防治仔豬病毒性胃腸炎的應(yīng)用效果，通過(guò)產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌等益生菌發(fā)酵銀杏葉、桑葉等中藥材制備中藥制劑并研究其體外抑菌、抗病毒和現(xiàn)場(chǎng)防治效果。結(jié)果表明，中藥發(fā)酵制劑對(duì)仔豬腹瀉病原菌具有中度敏感作用，抑菌圈平均直徑達(dá)到12.6 mm，并具有一定的抗TGEV活性作用，其治療指數(shù)與傳統(tǒng)中藥材板藍(lán)根、敗醬草基本相當(dāng)，其中抗吸附作用和抑制病毒復(fù)制作用明顯。添加5 g/kg中藥發(fā)酵制劑具有良好的病毒性胃腸炎仔豬治療效果，其治療效果與常規(guī)藥物治療相當(dāng)。中藥發(fā)酵制劑的生產(chǎn)與應(yīng)用可為防治微生物病原菌引起的仔豬病毒性胃腸炎提供一條有效的途徑。

銀杏葉；桑葉；中藥；發(fā)酵制劑；仔豬；胃腸道疾病

銀杏葉是孑遺植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，具有多種重要生理功能的活性成分，研究表明，銀杏葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等常見的仔豬腸道菌均表現(xiàn)出一定的體外抑菌作用，可在畜禽養(yǎng)殖中開發(fā)應(yīng)用［1］。桑葉是桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥葉，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清肺潤(rùn)燥的功效［2］。中藥具有純天然、安全有效、副作用小的特點(diǎn)，近年來(lái)在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其對(duì)畜禽養(yǎng)殖起到了防治相關(guān)疾病、改善機(jī)體免疫功能等作用。微生物發(fā)酵中藥制劑是一種新型的中藥炮制方法，微生物的降解作用使得中藥有效成分得到最大程度的溶解和提取，甚至可以增加新的有效活性成分，應(yīng)用效果要強(qiáng)于未發(fā)酵的中藥制劑。此外，發(fā)酵制劑中的益生菌對(duì)斷奶仔豬因應(yīng)激引起的胃腸道失衡引起的腹瀉具有很好的調(diào)節(jié)和輔助治療作用［3］。因此，本文根據(jù)傳統(tǒng)中獸醫(yī)藥理學(xué)知識(shí)，選擇具有提高生豬機(jī)體免疫力，又具有抗菌、抗病毒作用的銀杏葉、桑葉等中藥材進(jìn)行配伍組合，益生菌株發(fā)酵制備中藥發(fā)酵制劑，考察其對(duì)引起仔豬病毒性胃腸炎的微生物菌株體外抑菌和抗病毒效果，并對(duì)其防治進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，分析試驗(yàn)效果，為中藥發(fā)酵制劑在畜禽養(yǎng)殖中的開發(fā)與應(yīng)用提供相關(guān)的基礎(chǔ)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料銀杏葉、桑葉、菊花等中藥材：藥店購(gòu)買的干燥藥材，粉碎、過(guò)20～40目篩備用。

發(fā)酵菌株：市場(chǎng)購(gòu)買的飼料級(jí)微生物菌株的凍干菌粉，經(jīng)拮抗試驗(yàn)，篩選得發(fā)酵效果良好，且對(duì)所配伍中藥無(wú)拮抗作用的兩種菌株，產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

發(fā)酵中藥制劑的配方：銀杏葉40%、桑葉30%、菊花10%、黃苓10%、黃芪5%、紅糖5%。

供試仔豬：2013年7月-2015年6月福建省長(zhǎng)泰縣五通順發(fā)畜牧有限公司豬場(chǎng)共發(fā)病仔豬430頭，均表現(xiàn)出一定程度的嘔吐、腹瀉，排便稀糊狀、味腥臭，體溫短期升高，體重下降，有口渴、明顯脫水的現(xiàn)象，經(jīng)確診為仔豬病毒性胃腸炎，病因可能為飼養(yǎng)環(huán)境差、飼養(yǎng)管理不當(dāng)和多種病因混合感染所致。

小鼠：健康普通小鼠55只，體重為20～22 g，雌雄各半，由龍巖市第二醫(yī)藥檢驗(yàn)科提供。

病毒和細(xì)胞：豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis Virus of swine，TGEV）和IBRS-2細(xì)胞均由龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所分離、保存和繁殖的毒株和細(xì)胞，細(xì)胞接毒培養(yǎng)48～72 h后鏡檢，據(jù)CPE情況，按Reed-Meuench法計(jì)算，所用TGEV的TCID50為10-4.7。

1.2方法

1.2.1中藥發(fā)酵制劑的制備所篩選的兩種發(fā)酵菌株分別活化、液體培養(yǎng)增殖至109～1010CFU/ mL，等比例接種至中藥制劑中，總接種量為總發(fā)酵物料的3%～5%，用溫水控制最終含水量在30%～40%。采用帶單向呼吸閥的4層復(fù)合PE膜進(jìn)行密封固態(tài)厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度20℃～30℃，堆積發(fā)酵，時(shí)間15～20 d。發(fā)酵過(guò)程中臌氣明顯、顏色變深，發(fā)酵后無(wú)酸臭味、霉變等異常現(xiàn)象，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)酵后總菌數(shù)含量高（2.56*1010CFU/g）。

1.2.2仔豬腹瀉病原菌的分離、鑒定及抑菌試驗(yàn)

用10個(gè)滅菌棉簽分別沾取腹瀉仔豬的糞便，涂布于麥康凱培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)、顯微鏡檢，并進(jìn)行生理生化鑒定。鑒定后各菌落培養(yǎng)至109-1010CFU/mL，分別小鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)，等量注射無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作對(duì)照，觀察小鼠48 h內(nèi)的發(fā)病、死亡情況，并對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢。分別采用頭孢三嗪、頭孢他啶、氨芐西林等抗生素和發(fā)酵中藥制劑進(jìn)行各菌落的抑菌試驗(yàn)，各藥物配置成適當(dāng)濃度溶液浸泡濾紙片，中藥制劑采用熱水浸提液浸泡，按照常規(guī)K-B法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定各抑菌圈的大小。判斷標(biāo)準(zhǔn)：大于15 mm為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；小于10 mm低敏。

1.2.3中藥制劑抗病毒活性試驗(yàn)將發(fā)酵后的中藥制劑經(jīng)水浸醇沉、過(guò)濾除菌后作為中藥原液，同時(shí)以抗病毒較強(qiáng)的傳統(tǒng)中藥板藍(lán)根、敗醬草作為對(duì)照，按姜成剛［4］等人的方法測(cè)定這幾種中藥原液對(duì)IBRS-2細(xì)胞最大無(wú)毒濃度及抗TGEV活性，以治療指數(shù)（最大無(wú)毒濃度與最小有效濃度的比值）為評(píng)定藥效的指標(biāo)，試驗(yàn)均在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行，病毒液為100TCID50，37℃下培養(yǎng)2 h。

1.2.4中藥發(fā)酵制劑對(duì)仔豬病毒性胃腸炎的應(yīng)用試驗(yàn)分別采用高、中、低劑量的中藥發(fā)酵制劑和常規(guī)藥物治療發(fā)病仔豬，對(duì)仍有食欲仔豬，發(fā)酵制劑分別按10、5、1 g/kg量拌喂，常規(guī)藥物選用痢菌凈、痢特靈等藥物拌料喂食；無(wú)食欲仔豬，發(fā)酵制劑按相同用量采用灌服的方式進(jìn)行治療，常規(guī)藥物采用病毒唑等靜脈滴注2～4 mL。上述治療均連續(xù)使用3～5 d，每天1～2次。統(tǒng)計(jì)各組藥物治療頭數(shù)、使用療效和效果比例，并對(duì)治愈1周后的情況進(jìn)行跟蹤，觀察是否有復(fù)發(fā)情況，療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）死亡：用藥療程沒有完結(jié)，發(fā)病豬已經(jīng)死亡；（2）無(wú)效：臨床癥狀沒有得到較好控制，群體發(fā)病有所增加；（3）有效：臨床癥狀得到有效控制，癥狀減輕或好轉(zhuǎn)；（4）痊愈：病情癥狀消失，群體癥狀得到有效控制，糞便成形，色澤正常，飲水采食基本恢復(fù)［5］。

2　結(jié)果與分析

2.1仔豬腹瀉病原菌的分離、鑒定及抑菌試驗(yàn)結(jié)果10個(gè)滅菌棉簽涂布的各麥康凱培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)，典型菌落的顯微形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果均符合大腸桿菌的特征。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離的10個(gè)典型菌株中，強(qiáng)毒株占60%，接種的小鼠在48 h內(nèi)全部死亡；中毒株占30%，接種的小鼠在48 h內(nèi)大部死亡；弱毒株占10%，接種的小鼠在48 h內(nèi)僅1只死亡。從死亡小鼠的肝臟、脾臟、心臟和血液組織中，均分離得到了與接種菌一致的細(xì)菌。10個(gè)平板典型菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果基本一致，見表1所示，表明所分離菌株已對(duì)氨芐西林、慶大霉素等有了一定的耐藥性，雖然敏感性不如頭孢類抗生素，但其對(duì)發(fā)酵中藥制劑已達(dá)中度敏感，抑菌圈大小平均為12.6 mm，還是具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1　分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果（直徑mm）

2.2中藥制劑抗病毒活性試驗(yàn)中藥制劑抗病毒活性試驗(yàn)結(jié)果見表2所示，結(jié)果表明，中藥發(fā)酵制劑具有一定的抗TGEV活性的作用，其治療指數(shù)與傳統(tǒng)中藥材板藍(lán)根、敗醬草基本相當(dāng)，其中抗吸附作用和抑制病毒復(fù)制作用明顯，推測(cè)可能是所選中藥材銀杏葉中具有黃酮類成分，黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抑制病毒的穿入與吸咐，阻斷病毒復(fù)制過(guò)程所需信號(hào)的傳遞從而抑制病毒復(fù)制的作用［6］。

表2　傳統(tǒng)中藥材與中藥發(fā)酵制劑的抗病毒活性

2.3中藥發(fā)酵制劑對(duì)仔豬病毒性胃腸炎的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果不同劑量的中藥發(fā)酵制劑對(duì)仔豬病毒性胃腸炎治療效果統(tǒng)計(jì)如表3所示，結(jié)果表明隨著發(fā)酵制劑濃度的增加，其治療痊愈、有效的百分比增加，無(wú)效、死亡的百分比下降，治療效果呈遞增趨勢(shì)，其中高、中濃度組的治療效果明顯優(yōu)于低濃度組，與常規(guī)藥物治療效果相當(dāng)，但高、中濃度組之間的差異并不明顯。因此，綜合考慮選擇添加5 g/kg濃度的中藥發(fā)酵制劑用于病毒性胃腸炎仔豬的治療，其痊愈率為81.7%，總有效率達(dá)到了97.5%，均高于其他使用未經(jīng)發(fā)酵的中藥治愈仔豬病毒性胃腸炎疾病所報(bào)道的數(shù)值［7］。所治愈仔豬觀察1周后未發(fā)現(xiàn)有病情反復(fù)情況，表明治療取得了良好的效果。

表3　中藥發(fā)酵制劑對(duì)仔豬病毒性胃腸炎治療效果

3　討論

本文通過(guò)益生菌發(fā)酵銀杏葉、桑葉等中藥材制備中藥制劑，體外試驗(yàn)表明其對(duì)仔豬腹瀉病原菌具有中度敏感作用，抑菌圈平均直徑達(dá)到12.6 mm，且同樣具有一定的抗TGEV活性作用，其治療指數(shù)與傳統(tǒng)中藥材板藍(lán)根、敗醬草基本相當(dāng)，其中抗吸附作用和抑制病毒復(fù)制作用明顯。添加5 g/kg中藥發(fā)酵制劑具有良好的病毒性胃腸炎仔豬治療效果，其治療效果與常規(guī)藥物治療相當(dāng)。

益生菌發(fā)酵中藥制劑具有調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的雙重功效。一方面其中藥成分可以促進(jìn)抗體生成、修復(fù)免疫器官、增強(qiáng)機(jī)體解毒抗病機(jī)制；另一方面，益生菌可以調(diào)節(jié)和維護(hù)機(jī)體腸道生態(tài)平衡，降低外源病菌的感染機(jī)率。此外，中藥的有效活性成分還具有直接抗菌、抗病毒作用，因此，中藥發(fā)酵制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用可為防治病原菌引起的仔豬病毒性胃腸炎提供一條有效的途徑［8］。

［1］黃其春，張桂招，林梅香，等.銀杏葉提取物及其含藥血清對(duì)仔豬腸道菌的體外抑菌作用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：185-187.

［2］陳燕，蔣德俊.桑葉的功效與桑葉茶開發(fā)［J］.蠶桑茶葉通訊，2012（1）：2-3.

［3］劉鋒，韓春楊，劉翠艷，等.微生物發(fā)酵中藥飼料添加劑的研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2014，36（2）：18-22.

［4］姜成剛，張秀英，龍忠臣.中藥抗豬傳染性胃腸炎病毒活性及作用機(jī)理觀察［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2005，41（8）：3-32.

［5］邱長(zhǎng)興、吳法廣，馬逢海.中藥強(qiáng)普生拓治療豬胃腸炎臨床療效［J］.當(dāng)代畜牧，2008（10）：45-46.

［6］嚴(yán)敏，唐筱露.黃酮類化合物抗病毒作用研究概況［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（9）：149-151.

［7］張明武.2種中藥制劑治療豬傳染性胃腸炎效果的觀察［J］.獸藥，2013（2）：169.

［8］林建坤，馬壽欣，王中杰.中藥方劑胃腸寧預(yù)防斷奶仔豬傳染性胃腸炎的體會(huì)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，50（10）：51-52.

Research on theapplication effect of prevention and treatment on viral gastroenteritis in piglets using ginkgo biloba leaves and mulberry leaves mixtures fermentation for chinesemedicinal preparation

LIN Biao-sheng1，2，WU Jiang-wen1，DAI Ai-ling1，2，YANG Xiao-yan1，2
（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Veterinary Biotechnology（longyan University），Longyan 364012，China）

To study the effect of prevention and treatment on viral gastroenteritis in piglets using Chinese medicinal preparation，ginkgo biloba leaves and mulberry leaves were mixed and then fermented by Candida utilis and Bacillus subtilis.Antibacterial，anti-virus and field control effect of chinese medicinal preparation were studied.The results indicated that the traditional Chinese medicine fermentation preparation had the moderate sensitivity to the piglet diarrhea pathogenic bacteria，and its average diameter of the inhibition zone was 12.6 mm.The traditional Chinese medicine fermentation preparation also had a certain anti TGEV activity，and the numerical value of its therapeutic index was basically equivalent to the traditional Chinese medicine Radix isatidis and Herba patriniae.The function of anti-adsorption and inhibition of viral replication among them were obvious.Addition of 5 g/kg traditional Chinese medicine preparation had good therapeutic effects for the treatment of viral gastroenteritis in piglets，and was equivalent to drug treatment.The production and application of traditional Chinese medicine preparation could provide an effective way to prevent and cure the viral gastroenteritis in piglets caused by microbial pathogens.

Ginkgo leaf；mulberry leave；chinese medicine；piglet；gastrointestinal disease

YANG Xiao-yan

R 285

A

0529-6005（2016）09-0056-03

2015-10-12

省科技廳設(shè)區(qū)市屬高?？蒲辛㈨?xiàng)項(xiàng)目（JK2014051）；福建省發(fā)改委省級(jí)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目［閩發(fā)改高技（2013）577］；省科技廳重大專項(xiàng)專題項(xiàng)目（2014NZ0002）；省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S20141020）

林標(biāo)聲（1980-），男，講師，碩士，主要從事微生物發(fā)酵研究，E-mail：150391768@qq.com

楊小燕，E-mail：Lyyxy1988@126.com