宋瑞其，王振寶，張　楊，李永暢，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆 伊寧 835000）

阿勒泰部分地區(qū)放牧馬梨形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查

宋瑞其1，王振寶2，張楊1，李永暢1，巴音查汗1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆 伊寧 835000）

為了解阿勒泰部分地區(qū)放牧馬梨形蟲(chóng)病的流行情況，筆者運(yùn)用前期所建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法結(jié)合傳統(tǒng)血涂片鏡檢方法，對(duì)吐?tīng)柡猷l(xiāng)、克孜勒希勒克牧場(chǎng)及鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)等3個(gè)地區(qū)的134匹放牧馬進(jìn)行了馬梨形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查；經(jīng)FQ-PCR檢測(cè)得出，以上3個(gè)地區(qū)的感染率分別為36.96%，45.76%和31.03%，以克孜勒希勒克牧場(chǎng)最為嚴(yán)重；3個(gè)地區(qū)均以感染駑巴貝斯蟲(chóng)為主；根據(jù)年齡段分析，幼駒的感染率高于成年馬匹。應(yīng)用SPSS軟件分析得知，不同地區(qū)和不同年齡階段的馬匹感染梨形蟲(chóng)病差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，阿勒泰地區(qū)是馬梨形蟲(chóng)病的流行地區(qū)。

馬梨形蟲(chóng)??；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；血涂片鏡檢法；流行病學(xué)調(diào)查

馬梨形蟲(chóng)病（Equine piroplasmosis）是一種寄生于馬屬動(dòng)物的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)的蜱源性傳染病，又稱馬焦蟲(chóng)病、馬血孢子蟲(chóng)病。病原分為馬泰勒蟲(chóng)（Theileria equi）和駑巴貝斯蟲(chóng)（Babesia caballi）。此病主要集中發(fā)生于2～6月份和9～11月份等兩個(gè)時(shí)間段。流行區(qū)域（自然疫源地）主要包括歐洲、非洲、亞洲、美洲等大部分熱帶及亞熱帶地區(qū)［1］，在我國(guó)的甘肅、青海、黑龍江、新疆等多個(gè)北方地區(qū)常有相關(guān)報(bào)道［2］。發(fā)病初期體溫呈間歇熱或不定熱型，精神不振，食欲減退，眼瞼水腫，隨繼出現(xiàn)貧血、黃疸、出血和呼吸困難等癥狀，若診斷和治療不及時(shí)，死亡率極高。為此筆者對(duì)阿勒泰隨機(jī)抽取了吐?tīng)柡猷l(xiāng)、克孜勒希勒克牧場(chǎng)、鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)等3個(gè)地區(qū)的無(wú)癥狀放牧馬匹進(jìn)行梨形蟲(chóng)病的檢測(cè)。旨在了解該地區(qū)馬梨形蟲(chóng)感染情況，為阿勒泰地區(qū)的放牧馬群開(kāi)展有效的馬梨形蟲(chóng)病綜合防制工作提供可靠的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品來(lái)源134份放牧馬抗凝血樣品，于2014年7月份采自阿勒泰吐?tīng)柡猷l(xiāng)（46份）、克孜勒希勒克牧場(chǎng)（59份）、鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)（29份）等3個(gè)地區(qū)，并現(xiàn)場(chǎng)制作血涂片。

1.2樣品DNA提取取馬全血200 μL，用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供的樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒，進(jìn)行馬全血DNA的提?。ㄔ诟啕}狀態(tài)下，DNA純化樹(shù)脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來(lái)）。提取的全血DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與儀器瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液：Ⅰ液和Ⅱ液（參照參考文獻(xiàn)［3］）；樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；10×PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶寶生物工程（大連）有限公司；ND-2000c型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo sciencetific公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.4引物與探針駑巴貝斯蟲(chóng)和馬泰勒蟲(chóng)特異性引物及TaqMan探針均由本實(shí)驗(yàn)室建立，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.5馬梨形蟲(chóng)檢測(cè)方法

1.5.1血液涂片檢查將自然晾干的待染色血片水平放置，滴甲醇溶液至完全覆蓋血膜，使其固定，自然晾干。滴加I液3滴，使其蓋滿血膜，室溫在15℃左右時(shí)可染1 min，然后滴加Ⅱ液［3］6滴，輕輕搖動(dòng)玻片與染液充分混合1.5 min后，用水沖去染液，待干后鏡檢。

1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)以樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取的馬全血DNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。檢測(cè)馬泰勒蟲(chóng)與駑巴貝斯蟲(chóng)的反應(yīng)體系為（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，探針P 0.6 μL，rTaq DNA聚合酶 0.3 μL，加去離子水補(bǔ)至25 μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，共40個(gè)循環(huán)；56℃退火50 s，每個(gè)循環(huán)退火延伸可收集熒光信號(hào)。

1.5.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)134份熒光定量PCR檢測(cè)全血樣本的數(shù)據(jù)，進(jìn)行不同地區(qū)、不同年齡段、感染率之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1血液涂片檢查對(duì)阿勒泰地區(qū)采集的全血樣品進(jìn)行血涂片鏡下觀察，吐?tīng)柡猷l(xiāng)的46份血液中15份為陽(yáng)性感染，感染率為19.57%，紅細(xì)胞的平均染蟲(chóng)率為0.65%；克孜勒希勒克牧場(chǎng)的59份血液中14份為陽(yáng)性感染，感染率為23.73%，紅細(xì)胞的平均染蟲(chóng)率為0.70%；鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)的29份血液中9份為陽(yáng)性感染，感染率為31.03%，紅細(xì)胞的平均染蟲(chóng)率為0.31%。馬梨形蟲(chóng)分為馬泰勒蟲(chóng)和駑巴貝斯蟲(chóng)，在顯微鏡下蟲(chóng)體多位于紅細(xì)胞的中央。馬泰勒蟲(chóng)呈圓形、逗點(diǎn)狀；駑巴貝斯蟲(chóng)典型的蟲(chóng)體為雙梨形，以其尖端聯(lián)成銳角，每個(gè)蟲(chóng)體有兩團(tuán)染色質(zhì)塊。在一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)通常只有1～2個(gè)蟲(chóng)體染蟲(chóng)。紅細(xì)胞大部分較完整，有時(shí)出現(xiàn)空泡，呈圓盤(pán)狀，中間凹陷（見(jiàn)圖1）。

圖1　顯微鏡下觀察梨形蟲(chóng)的部分結(jié)果

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查

2.2.1不同地區(qū)馬感染梨形蟲(chóng)病的情況熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品出現(xiàn)了特異性的S形，陰性樣品未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增（見(jiàn)圖2）。

根據(jù)不同地區(qū)分析，吐?tīng)柡猷l(xiāng)，克孜勒希勒克牧場(chǎng)和鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)等3個(gè)地區(qū)放牧馬匹，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)馬梨形蟲(chóng)的感染率分別為36.96%， 45.76%和31.03%，經(jīng)傳統(tǒng)血涂片檢測(cè)的感染率分別為19.57%，23.73%和31.03%。由此可得，熒光定量PCR方法靈敏度高且檢出率明顯高于或等于血涂片鏡檢方法（見(jiàn)表1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同牧場(chǎng)之間感染梨形蟲(chóng)率差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.2不同年齡段馬感染梨形蟲(chóng)病的情況134份血液樣本經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)后，不同年齡段的馬感染梨形蟲(chóng)的情況見(jiàn)表2。

圖2　熒光定量PCR檢測(cè)梨形蟲(chóng)的部分結(jié)果

表1　馬梨形蟲(chóng)病檢查結(jié)果

表2　不同年齡段馬感染梨形蟲(chóng)的情況

其中，駑巴貝斯蟲(chóng)的總陽(yáng)性率為26.87%（36/ 134），馬泰勒的總陽(yáng)性率為18.66%（25/134），以感染駑巴貝斯蟲(chóng)為主；按不同年齡分組進(jìn)行比較，各年齡段的馬均可感染馬梨形蟲(chóng)。在“＜1歲”與“4-6歲”兩個(gè)年齡段的感染率較高，分別為54.29%（19/35）和41.67%（5/12），幼駒相對(duì)易感。經(jīng)SPSS軟件分析，不同年齡段對(duì)感染馬梨形蟲(chóng)率的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

3　討論

近年來(lái)，馬梨形蟲(chóng)病的發(fā)病較為普遍，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展，一直倍受國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界關(guān)注。目前，馬梨形蟲(chóng)病的診斷技術(shù)主要有根據(jù)臨床癥狀［4-6］和血涂片染色鏡檢［7］的常規(guī)診斷方法、免疫學(xué)方法［8-10］、普通PCR方法［11］等，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是一種特異性、敏感性均較高的方法。因此，本次試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)阿勒泰3個(gè)地區(qū)的放牧馬進(jìn)行了梨形蟲(chóng)病的檢測(cè)，以此提高檢測(cè)樣本的準(zhǔn)確度。

圖3　不同年齡段馬感染梨形蟲(chóng)的情況

通過(guò)本次試驗(yàn)得出，F(xiàn)Q-PCR方法檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為36.96%，45.76%，31.03%。明顯高于血涂片鏡檢方法檢測(cè)的陽(yáng)性率（19.57%，23.73%，31.03%）。為避免熒光定量PCR假陽(yáng)性干擾，對(duì)鏡檢陰性而熒光定量PCR為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示，這些樣品均為駑巴貝斯蟲(chóng)及馬泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性。表明熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果并無(wú)假陽(yáng)性干擾。對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果利用SPSS軟件分析得知不同牧場(chǎng)之間和不同年齡段之間，對(duì)感染馬梨形蟲(chóng)病的影響均無(wú)顯著差異。3個(gè)地區(qū)中克孜勒希勒克牧場(chǎng)的感染率最高為45.76%；駑巴貝斯蟲(chóng)?。?6.87%）的感染率高于馬泰勒蟲(chóng)（18.66%）；在不同年齡段中幼駒（54.29%）的感染率高于成年馬，幼駒較易感［5］。

馬梨形蟲(chóng)病的傳播必須依賴硬蜱［12］，阿勒泰地區(qū)有著特殊的地理?xiàng)l件和豐富的草場(chǎng)資源，孳生的蜱蟲(chóng)種類較多，放牧條件下馬匹極易受到蜱蟲(chóng)侵?jǐn)_，這給馬匹感染梨形蟲(chóng)提供了有利條件。應(yīng)對(duì)草場(chǎng)和圈舍采用超低容量噴霧進(jìn)行滅蜱［12］，以從傳播途徑上阻斷梨形蟲(chóng)的傳播。針對(duì)該地區(qū)無(wú)癥狀的馬匹（均為傳染源），熒光定量PCR方法可以靈敏、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)的馬梨形蟲(chóng)感染與否。將分子診斷技術(shù)推廣、常規(guī)化，可以起到早期診斷的作用［13］。為進(jìn)一步對(duì)該病的診治提供依據(jù)，望相關(guān)部門(mén)能對(duì)本病給予重視，以控制該病的繼續(xù)蔓延和向更加嚴(yán)重的趨勢(shì)發(fā)展。

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Epidemiological survey of Piroplasmosis in thegrazing horses in someparts Altay Prefectur

SONG Rui-qi1，WANG Zhen-bao2，ZHANG Yang1，LI Yong-chang1，BA Yinchahan1
（1.College of Animal Medicine，Xinjiang Agriculture University，Urumqi 830052，China；2.Yili Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yining 835000，China）

To understand the epidemic situation of grazing horses infected with piroplasmosis from some areas in Altay region，a epidemiological survey was conducted to examine piroplasmosis using Taqman prode-based RTFQ-PCR method and microscopic examination of Giemsa-stained blood smears.Total A total of 134 random samples were detected.The results showed that the infection rate detected by RTFQ-PCR method in Tuerhong，Kezilexileke，and Tiemaike were 36.96%，45.76%，and 31.03%，respectively.The severest region for the infection of piroplasmosis was Kezilexileke.The infection rate of Babesia caballi was higher than that in Theileria equi.The infection rate in foals was higher than that in adult horses.There were no significant differences in horses infected with piroplasmosis from different areas and different ages（P＞0.05）.The survey confirms that Altay region is an epidemic region of piroplasmosis.

Equine piroplasmosis；Taqman prode-based RTFQ-PCR；microscopic examination of Giemsa-stained bloodsmears；molecular epidemiology

BA Yinchahan

S852.7

A

0529-6005（2016）04-0013-03

2015-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（U14-03283）；自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項(xiàng)目（xjaucxyyjs-20141003）

宋瑞其（1990-），男，碩士生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：812084208@qq.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com