彭小兵，李旭妮，蔣玉文，張愛民，余洪磊，羅顯繹，陳　宏，鄭明舉，沈　方，趙海源

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠，甘肅 蘭州 730046；3.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

腐敗梭菌類毒素抗原含量與免疫效果之間的關系試驗

彭小兵1，李旭妮1，蔣玉文1，張愛民2，余洪磊3，羅顯繹2，陳宏3，鄭明舉2，沈方2，趙海源3

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠，甘肅 蘭州 730046；3.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

為了確定腐敗梭菌類毒素抗原含量與免疫效果之間的關系，將不同劑量的類毒素分別接種家兔和綿羊，免疫17日后測定血清中和效價，并用1MLD的毒素進行攻毒。測毒結果表明，1個家兔MLD的毒素含量為小鼠MLD的30倍，1個綿羊MLD的毒素含量為小鼠MLD的600倍。血清中和試驗和免疫攻毒保護結果表明，類毒素含量與免疫效果在一定的范圍內(nèi)呈正相關，在家兔和綿羊上能提供保護的最小免疫劑量分別為100個小鼠MLD和300個小鼠MLD的類毒素。本試驗結果為腐敗梭菌疫苗的研制提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

腐敗梭菌；類毒素；免疫效果；含量

腐敗梭菌（C.septicum）為革蘭陽性桿菌，可引起人和動物的惡性水腫、肌肉壞死、氣性壞疽及壞死性腸炎等疾病。該菌典型特征是在動物體內(nèi)尤其是在肝被膜和腹膜上可形成長達數(shù)百μL的長絲［1-2］，在其所產(chǎn)生的α、β、γ、δ 4種外毒素中，α毒素是主要的致死性毒力因子［3-4］。羊經(jīng)由消化道感染引起的羊快疫（Braxy）［5］，是一種常見多發(fā)非接觸急性致死性傳染病，以突然發(fā)病、病程很短、多呈急性死亡、真胃發(fā)生出血性炎癥為主要特征。且發(fā)病羊多為育肥羊，給養(yǎng)羊業(yè)造成了很大的損失。免疫接種是預防該病的最為有效的途徑之一，目前，我國用于預防羊快疫的疫苗主要有羊快疫、黑疫二聯(lián)滅活疫苗、羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗、羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活苗等［6］。然而，筆者統(tǒng)計此類疫苗近8年來的檢驗結果發(fā)現(xiàn)，其合格率卻不高。因此，為了確定腐敗梭菌類毒素含量與免疫效果之間的關系，本試驗以不同的類毒素含量分別接種家兔和綿羊，免疫后測定血清效價并進行攻毒，以期得到能使動物獲得足夠保護的抗原含量，為此類疫苗的研制、檢驗及提高疫苗質(zhì)量奠定基礎。

1　材料與方法

1.1菌株、培養(yǎng)基、溶液、試劑腐敗梭菌C55-1（CVCC60021）株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。腐敗梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基由本實驗室自主研制，生理鹽水、明膠緩沖液、葡萄糖溶液等參照《中國獸用生物制品規(guī)程》［2］配制。

1.2試驗動物綿羊，5～6月齡，雄性，品種為藏羊和蒙古羊雜交系，購自甘肅張掖山丹軍馬場。CD-1（ICR）小鼠，體重16～20 g，SPF級；日本大耳白家兔，體重1.5～2.0 kg，清潔級，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3類毒素制備類毒素的含量用“每毫升含N個小鼠MLD”來表示。取種子接種腐敗梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，培養(yǎng)完成后取樣測定毒素對小鼠的致死量，剩余培養(yǎng)物加入甲醛滅活脫毒，滅活脫毒完成后3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，加入滅菌鋁膠、注射用水混勻，調(diào)pH值至6.5～7.0，使鋁膠的終濃度為0.2 g/mL，使腐敗梭菌類毒素的含量為200個小鼠MLD/mL，置2℃～8℃保存。

1.4腐敗梭菌毒素對小鼠、家兔和綿羊的毒力測定取培養(yǎng)完成后的菌液，以30 00 r/min離心30 min，棄沉淀，上清用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為毒素，分裝成小份于試管中，-70℃保存。每次從冰箱中取出一支新毒素待冰融化后，用明膠緩沖液進行適當稀釋，以不同滴度分別尾靜脈注射小鼠、耳靜脈注射家兔、頸靜脈注射綿羊，每滴度注射2只，觀察3日。能使動物2/2死亡的最小毒素量即為對該動物的最小致死量（MLD）。

1.5在家兔上類毒素含量與免疫效果之間的關系研究免疫前每只家兔采血5 mL，分離血清，按《中國獸藥典》［6］的方法測定血清對腐敗梭菌毒素的中和效價。血清效價是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD數(shù)”。取制備好的腐敗梭菌類毒素，分別以1.0 mL（200個小鼠MLD）、0.75 mL（150個小鼠MLD）、0.5 mL（100個小鼠MLD）和0.3 mL（60個小鼠MLD）的劑量肌肉注射家兔各4只，同時設未注射家兔2只作為空白對照。

1.5.1家兔血清中和效價測定免疫后17日，每只家兔耳動脈采血5 mL，分離血清，測定每組4只家兔混合血清對腐敗梭菌毒素的中和效價。

1.5.2家兔攻毒保護試驗免疫后21日，取各免疫組4只連同對照組2只家兔，每只各耳緣靜脈注射1個家兔MLD毒素，觀察5日。

1.6在綿羊上類毒素含量與免疫效果之間的關系研究免疫前每只綿羊采血10 mL，分離血清，按《中國獸藥典》［6］的方法測定血清對腐敗梭菌毒素的中和效價。血清效價是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD數(shù)”。取制備好的腐敗梭菌類毒素，分別以1.5 mL（300小鼠MLD）、1.0 mL（200小鼠MLD）和0.5 mL（100小鼠MLD）的劑量頸部肌肉注射綿羊各5只，同時設未注射綿羊5只作為空白對照。

1.6.1綿羊血清中和效價測定免疫后17日，每只綿羊頸靜脈采血10 mL，分離血清，測定每只綿羊血清對腐敗梭菌毒素的中和效價。

1.6.2綿羊攻毒保護試驗免疫后21日，取各免疫組5只連同對照組5只綿羊，每只各頸靜脈注射1個綿羊MLD毒素，觀察5日。

2　結果

2.1腐敗梭菌毒素的毒力測定將制備好的毒素稀釋成不同滴度后分別靜脈注射小鼠、家兔和綿羊，動物的死亡情況如表1所示。由此可知，1個小鼠MLD為0.004 mL的毒素原液，1個家兔小鼠MLD為0.12 mL的毒素原液（30個小鼠MLD），1個綿羊MLD為2.4 mL的毒素原液（600個小鼠MLD）。

2.2在家兔上類毒素含量與免疫效果之間的關系研究對免疫前家兔血清進行測定，結果效價均小于1，均為腐敗梭菌毒素抗體陰性兔。將不同劑量的類毒素分別免疫家兔后，測定每組4只家兔混合血清對腐敗梭菌毒素的中和效價，并用1個家兔MLD（0.12 mL）進行攻毒，結果（表2）表明，在一定范圍內(nèi)類毒素含量與免疫效果呈正相關，類毒素含量為100 MLD和150 MLD時的血清效價和攻毒保護率均最高。參考《中國獸藥典》相關產(chǎn)品合格的標準“血清中和效價應達到1”和“對照組應2/2死亡，免疫組應至少3/4保護”可知，在家兔上血清效價和攻毒保護能同時滿足標準要求的最小免疫量為100個小鼠MLD。

2.3在綿羊上類毒素含量與免疫效果之間的關系研究對免疫前綿羊血清進行測定，結果效價均小于1，均為腐敗梭菌毒素抗體陰性羊。將不同劑量的類毒素分別免疫綿羊后，測定每只綿羊血清對腐敗梭菌毒素的中和效價，并用1個綿羊MLD（2.4 mL）進行攻毒，結果（表3）表明，在一定范圍內(nèi)類毒素含量與免疫效果呈正相關，類毒素含量為300 MLD時的血清效價和攻毒保護率均最高。參考《中國獸藥典》相關產(chǎn)品合格的標準“血清中和效價應達到1”和“對照組應2/2死亡，免疫組應至少3/4保護”可知，在綿羊上血清效價和攻毒保護能同時滿足標準要求的最小免疫量為300個小鼠MLD。

表1　腐敗梭菌毒素對小鼠、家兔和綿羊的毒力測定

表2　在家兔上類毒素含量與免疫效果之間的關系

3　討論

目前，在用于預防羊快疫的疫苗中，以羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗、羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗和羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗為主，近5年來這3種疫苗的總產(chǎn)量呈逐年增長的趨勢，2014產(chǎn)量為2010年的2.4倍。然而，筆者對2006年至今該3種疫苗的效力檢驗結果進行統(tǒng)計，結果以血清中和法［6］檢驗為不符合規(guī)定的產(chǎn)品共有33批，其中腐敗梭菌組分不符合規(guī)定的占15批（45.5%）。由此可見，腐敗梭菌組分血清抗體效價不高是導致該類疫苗不符合規(guī)定的主要因素，已成為當前亟待解決的問題。

表3　在綿羊上類毒素含量與免疫效果之間的關系

參考《規(guī)程》［2］的制苗標準經(jīng)計算可知，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗中所規(guī)定的接種家兔和羊的腐敗梭菌類毒素含量分別為“至少62.4個小鼠MLD”和“至少104.2個小鼠MLD”。為了弄清楚究竟多大的抗原含量可提供足夠的保護，本試驗采用不同的類毒素含量免疫動物后測定血清效價并進行攻毒，結果表明，在家兔和綿羊上能提供保護的最小免疫劑量分別為100個小鼠MLD和300個小鼠MLD的類毒素。這似乎為解釋“現(xiàn)有疫苗效力檢驗合格率不高”提供了一定的依據(jù)，即現(xiàn)有疫苗中腐敗梭菌組分的抗原含量可能并不足夠。尤為值得注意的是，本試驗的數(shù)據(jù)是用腐敗梭菌單組分滅活苗所獲得的最小免疫劑量結果，而將該劑量用在三聯(lián)苗甚至更多聯(lián)苗中，其能否誘發(fā)機體提供足夠的保護尚是未知數(shù)，仍需要進一步的試驗來證實。本試驗結果亦表明，在一定范圍內(nèi)類毒素含量與免疫效果呈正相關。因此，為解決目前傳統(tǒng)滅活疫苗效力檢驗合格率不高的問題，提高類毒素的抗原含量顯然是提高疫苗免疫效果的有效途徑之一。另一方面，Amimoto K等［7］的研究結果表明，在豚鼠上腐敗梭菌α類毒素在抵抗芽孢攻擊方面發(fā)揮了重要的作用。進而，重組表達腐敗梭菌梭菌α毒素基因［8-9］，也可能成為解決現(xiàn)有疫苗質(zhì)量不高的另一候選途徑。

此外，家兔是快疫類疫苗效力檢驗用動物，綿羊為疫苗使用的靶動物，然而《規(guī)程》［2］和《菌種目錄》［10］僅給出了腐敗梭菌對小鼠的毒力數(shù)據(jù)。本試驗對腐敗梭菌毒素在家兔和綿羊上的毒力進行了測定，補充了腐敗梭菌疫苗生產(chǎn)檢驗用菌株的毒力數(shù)據(jù)。

本試驗首次同時用血清中和法和免疫攻毒法，在家兔和綿羊上對腐敗梭菌類毒素含量和免疫效果之間的關系進行了研究，確定了各自的最小免疫保護劑量，為腐敗梭菌疫苗的研制提供了重要的基礎性參考數(shù)據(jù)。

［1］陸承平.獸醫(yī)微生物學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：194-196.

［2］農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會編.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二○○○版［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2000.

［3］Kennedy C L，Krejany E O，Young L F，et al.The alpha-toxin of Clostridium septicum is essential for virulence［J］.Mol Microbiol， 2005，57（5）：1357-1366.

［4］Kennedy C L，Lyras D，Cordner L M，et al.Pore-forming activity of alpha-toxin is essential for Clostridium septicum-mediated myonecrosis［J］.Infect Immun，2009，77（3）：943-951.

［5］Rodney K.Tweten.Clostridium perfringens beta toxin and Clostridium septicum alpha toxin their mechanisms and possible role in pathogenesis［J］.Vet Microbiol，2001，82：1-9.

［6］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

［7］Amimoto K，Ohgitani T，Sasaki O，et al.Protective effect of Clostridium septicum alpha-toxoid vaccine against challenge with spores in guinea pigs［J］.J Vet Med Sci，2002，64（1）：67-69.

［8］張燕，邊艷青，趙寶華.腐敗梭菌α毒素基因的克隆表達及其類毒素的免疫原性研究［J］.生物工程學報，2007，23（1）：67-72.

［9］彭國瑞.重組腐敗梭菌α毒素的免疫原性研究［D］.北京：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2014.

［10］中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編.中國獸醫(yī)菌種目錄［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2002.

Study on Relationship between Antigenic Amount ofClostridium SepticumToxoid and its ImmuneEffect

PENG Xiao-bing1，LI Xu-ni1，JIANG Yu-wen1，ZHANG Ai-min2，YU Hong-lei3，LUO Xian-yi2，CHEN Hong3，ZHENG Ming-ju2，SHEN Fang2，ZHAO Hai-yuan3
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.Lanzhou Bio-pharmaceutical Factory of China Animal Husbandry Industry CO.，Ltd，Lanzhou 730046，China；3.Xinjiang Tecon Animal Husbandry Bio-technology Co.，Ltd，Urumqi 830032，China）

In order to determine the relationship between the vaccinated amount of Clostridium septicum toxoid and its immune effect，we vaccinated rabbits and sheep with various toxoid doses respectively.Seventeen days later，serum neutralization titers were analyzed and animals were challenged with MLD toxin.The results of virulence measurement showed that the toxin amount of one rabbit MLD was 30 times of that of one mouse MLD and the toxin amount of one sheep MLD was 600 times of that of one mouse MLD.The results of serum neutralization test and challenge protective test indicated that there was a positive correlation to a certain extent between the vaccinated toxoid amount and its immune effect，and the minimum protective dose for rabbit and sheep was 100 and 300 mouse MLD toxoid respectively.Our results provided important and basic reference data for study and development of Clostridium septicum vaccine.

Clostridium septicum；toxoid；immune effect；amount

JIANG Yu-wen

S852.61

A

0529-6005（2016）04-0006-03

2015-03-06

動物生物制品國家工程研究中心項目

彭小兵（1983-），男，助理研究員，碩士，主要從事生物制品研發(fā)和檢驗方法研究工作，E-mail：673303882@qq.com

蔣玉文，E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn