蔣維維，易金娥,2,，譚柱良,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

γ-谷維素對過氧化氫誘導氧化損傷L02細胞的增殖和保護作用

蔣維維1，易金娥1,2,*，譚柱良1,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

目的：觀察γ-谷維素對過氧化氫誘導人肝細胞（L02）氧化損傷的增殖和保護作用的影響。方法：建立過氧化氫氧化損傷模型，采用不同濃度的γ-谷維素對L02細胞進行處理，檢測L02細胞增殖率、丙二醛和微量谷胱甘肽含量、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力及活性氧水平的變化。結(jié)果：γ-谷維素濃度在0.1～0.4 mmol/L對H2O2引起的細胞損傷具有修復作用，同時降低丙二醛含量和活性氧水平，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫活性以及谷胱甘肽含量，且呈量效關系。結(jié)論：L02細胞經(jīng)0.1～0.4 mmol/L γ-谷維素預處理后，可以緩解H2O2造成的氧化損傷，維持正常的生理形態(tài)。

γ-谷維素；氧化損傷；L02細胞

氧化應激是由于細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)之間不平衡所導致。過量的自由基攻擊大分子如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，對細胞造成嚴重損傷，導致健康障礙問題，如關節(jié)炎、糖尿病、神經(jīng)變性疾病、心腦血管疾病等[1]。許多研究證明，外源性抗氧化劑能抑制或減緩自由基生成，有效調(diào)節(jié)機體氧化還原平衡，減少氧化應激的產(chǎn)生[2-4]。γ-谷維素是米糠油中最重要的生物活性物質(zhì)之一，在米糠油中含量約1%～3%[5]，其他谷物油脂中也有發(fā)現(xiàn)，如玉米油、小麥、黑麥等。自Kaneko等[6]于1954年報道谷維素對動物具有很好的營養(yǎng)作用以來，引起了人們對γ-谷維素的廣泛研究與關注，隨后研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷維素具有抗氧化、降血脂、抗炎、抗胃酸分泌、抗癌以及調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性[7]，因而受到國內(nèi)外學者的廣泛重視。實驗證明，γ-谷維素可使小鼠血清和肝臟中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量明顯下降，且對小鼠體質(zhì)量無顯著影響，說明γ-谷維素具有較好的抗脂質(zhì)過氧化的作用[8]。但關于γ-谷維素對人肝細胞（L02）氧化損傷的影響還尚未報道。本實驗采用H2O2誘導L02細胞氧化損傷模型，研究γ-谷維素對氧化損傷L02細胞的氧化保護作用，以期為進一步揭示γ-谷維素抗氧化損傷的機制和臨床利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝細胞（L02） 湖南湘雅醫(yī)學院；γ-谷維素Oryza Oil & Fat Chemical公司；RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清 北京四季青公司；二氯熒光素二酯（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、胰蛋白酶和噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、微量還原型谷胱甘肽、總谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽（total-glutataione/reduced glutathione，T-GSH/GSSG）、MDA、蛋白質(zhì)檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；其余化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

W201恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；Thermo 3110二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Combi-514R冷凍離心機 韓國Hanil株式會社；Bio-Rad 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備工程有限公司；倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

取L02細胞復蘇，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含1%雙抗），于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每1～2 d換液，正常培養(yǎng)3～4 代后，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞的處理

將處于對數(shù)生長期的L02細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞，按3h104cells/mL接種。正常培養(yǎng)24 h后，細胞分組處理如下：正常對照組，H2O2模型組（10、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L處理1、2、3 h），γ-谷維素預處理組（0.05～0.5 mmol/L不同濃度的γ-谷維素孵育12 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，200 μmol/L H2O2處理2 h），用含1%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.3 細胞存活率測定

采用MTT法測定細胞存活率[9]。96 孔板中細胞分組處理，每組設定6 個復孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，用酶標儀檢測570 nm波長處光密度（OD）值。定義對照組細胞存活率為100%，其余各實驗組細胞存活率按下式計算。

1.3.4 細胞MDA、GSH含量以及SOD和CAT活力的檢測

收集約1h107cells用4 ℃預冷的PBS洗滌，用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，4 000hg離心，取上清，采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）顯色法測定MDA含量；將細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細胞培養(yǎng)上清液檢測SOD、CAT活力以及GSH含量。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定，GSH含量采用二硫代二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法測定，CAT活力采用鉬酸銨法測定，采用考馬斯亮藍法測定L02細胞總蛋白含量。總蛋白含量、SOD活力、T-GSH/GSSG和CAT活力以及MDA含量測定均按照文獻［10-12］方法進行。

1.3.5 細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen，ROS）水平的檢測

以DCFH-DA為熒光探針檢測L02細胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)ROS的水平。將L02細胞與無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA（終濃度為10 μmol/L）于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光顯微鏡檢測DCF熒光，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm[13]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析和Turkey’s多因素t檢驗，結(jié)果以表示，采用P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 L02細胞氧化損傷模型的建立

H2O2對L02細胞活性的影響如圖1所示，隨著H2O2濃度的增加，細胞存活率顯著降低，呈量效關系；H2O2分別處理細胞1、2、3 h，顯示隨著H2O2處理時間延長，細胞存活率也顯著降低，呈時效關系；200 μmol/L H2O2處理L02細胞1、2、3 h后，細胞存活率分別為60.7%、52.6%、48.9%。故本實驗選用200 μmol/L H2O2作用2 h為構建L02細胞氧化損傷模型的最佳濃度，用于后續(xù)實驗。選擇200 μmol/L，2 h是因為剛好此時對細胞致死率大概50%左右，一般藥物篩選實驗是根據(jù)IC50的結(jié)果得到最終值。若選擇3 h，細胞存活率偏低，不利于細胞后續(xù)恢復作用。

圖1 H2O2對L02細胞活性的影響Fig.1 Effect of H2O2on L02 cell viability

2.2 γ-谷維素對L02細胞增殖的影響

圖2 不同濃度γ-谷維素對L02細胞增殖的影響Fig.2 Effect of γ-oryzanol on the proliferation of L02 cells

用0.05～0.5 mmol/L濃度梯度的γ-谷維素處理L02細胞12 h，測定其對L02細胞增殖的影響，篩選γ-谷維素的安全劑量閾值和最佳作用濃度。結(jié)果如圖2所示，在0.1～0.5 mmol/L劑量范圍內(nèi)，γ-谷維素沒有降低細胞的活性，說明在該濃度范圍內(nèi)，γ-谷維素是安全無毒的，而且在0.05～0.4 mmol/L劑量范圍內(nèi)，隨著γ-谷維素濃度的增加，細胞活性增強，呈量效關系，以0.4 mmol/L γ-谷維素作用最顯著（P＜0.05）。0.5 mmol/L劑量下的效果沒有0.4 mmol/L的效果好。

2.3 γ-谷維素對L02細胞氧化損傷的保護作用

圖3 不同濃度γ-谷維素對H2O2致L02細胞氧化損傷保護作用的影響Fig.3 Effect of γ-oryzanol on cell viability of L02 cells induced by H2O2

由圖3可知，與正常對照組相比，H2O2模型組L02細胞活性極顯著降低（P＜0.01），表明氧化損傷模型誘導成功。與H2O2模型組相比，用γ-谷維素預處理后，在0.1～0.4 mmol/L濃度范圍內(nèi)，L02細胞活性增強，且呈量效關系，以0.4 mmol/L γ-谷維素作用最顯著（P＜0.01），細胞存活率為118.8%（圖2）。同時，采用倒置顯微鏡對L02細胞進行形態(tài)學觀察，正常對照組L02細胞呈扁平多角形，相鄰細胞連接成片，形態(tài)舒展，呈鋪路石狀，細胞生長良好，背景清晰（圖4A）；H2O2模型組單視野范圍內(nèi)細胞量明顯減少，部分細胞變圓，體積縮小，部分細胞開始漂?。▓D4B）；當用0.4 mmol/L γ-谷維素預處理12 h后，單視野范圍內(nèi)的L02細胞明顯增加，漂浮細胞明顯減少，細胞生長較好，排列較緊密，互相銜接性較好（圖4C），這進一步說明γ-谷維素對L02細胞氧化損傷具有保護作用。因此，根據(jù)細胞活性檢測和細胞形態(tài)學觀察，選用0.4 mmol/L作為最高劑量組，0.1、0.2 mmol/L γ-谷維素作為低、中劑量組用于后續(xù)實驗。

圖4 L02細胞形態(tài)變化（×40）Fig.4 Morphological change of L02 cells (×40)

2.4 γ-谷維素對H2O2誘導的L02細胞中MDA含量的影響

圖5誘導的L02細胞內(nèi)MDA含量的影響Fig.5 Effect of γ-oryzanol on MDA level in L02 cells γ-谷維素對H2O2

如圖5所示，H2O2處理造成L02細胞內(nèi)MDA含量極顯著升高（P＜0.01），造成L02細胞脂質(zhì)過氧化，而采用γ-谷維素預處理后，極顯著抑制MDA生成（P＜0.01），并呈量效關系，說明γ-谷維素緩解了H2O2引起的脂質(zhì)過氧化。

2.5 γ-谷維素對H2O2誘導的L02細胞中 SOD、CAT活力、GSH含量、T-GSH/GSSG的影響

表1γ-谷維素對H2O2誘導的L02細胞中SOD、CAT活力、GSH含量、T-GSH/GSSG的影響Table 1 Effect ofγ-oryzanol on the activities of SOD, CAT and the level of GSH, and the ratio of T-GSH/GSSG in L02 cells

由表1可知，L02細胞經(jīng)過H2O2處理后，SOD、CAT活力和GSH含量以及T-GSH/GSSG比值均顯著降低，說明H2O2對細胞造成了顯著的氧化性損傷，而加入γ-谷維素進行預處理后，隨著γ-谷維素濃度的增大，SOD、CAT活力和GSH含量以及T-GSH/GSSG比值顯著增加，呈量效關系。說明L02細胞經(jīng)過γ-谷維素預處理，可以有效緩解H2O2的氧化損傷，保護細胞免受氧化性損傷。

2.6 γ-谷維素對H2O2誘導的L02細胞ROS水平的影響

ROS主要通過與線粒體通透性轉(zhuǎn)換蛋白相互作用而在凋亡反應中起著重要作用。過量的ROS能促進細胞凋亡[14]，細胞內(nèi)ROS含量變化影響結(jié)果見圖6。與正常對照組相比，H2O2組L02細胞內(nèi)ROS水平急劇上升，增加了29.7%，且差異顯著（P＜0.05），說明H2O2能誘導L02細胞ROS水平增加。當用γ-谷維素預處理后，能顯著降低細胞內(nèi)ROS水平（P＜0.05），且呈量效關系。說明γ-谷維素能有效清除H2O2誘導細胞內(nèi)過度產(chǎn)生的ROS，具有清除自由基的能力。

圖6誘導的L02 細胞內(nèi)活性氧含量的影響Fig.6 Effect of γ-oryzanol on the level of ROS in L02 cells γ-谷維素對H2O2

3 討 論

氧化應激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)部存在有內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，包含酶類的CAT和SOD以及非酶類的GSH。內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)能幫助清除體內(nèi)過多的自由基和ROS以緩解氧化應激所造成的損傷[15]。ROS能通過多種機制而改變細胞的結(jié)構和功能的完整[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物之一，常常可反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[17]。SOD是機體細胞抵御氧化損傷最重要的酶類之一，主要功能是清除體內(nèi)有氧代謝所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，使機體和細胞免受損害[18]。H2O2被廣泛應用于體外氧化應激造模的誘導劑[19]，因此，當研究γ-谷維素的抗氧化性作用機制時，可采用H2O2誘導L02細胞的損傷，探究γ-谷維素對其的保護作用。根據(jù)實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，使用200 μmol/L H2O2作用2 h使得細胞存活率下降46%，GSH含量下降，CAT和SOD活力顯著下降，MDA水平顯著增加，細胞內(nèi)ROS含量上升。因此用H2O2誘導細胞損傷，使得細胞內(nèi)ROS過度產(chǎn)生，抗氧化劑（GSH）的消耗造成內(nèi)源性抗氧化防御機制的崩解，引起脂質(zhì)過氧化，最終導致細胞損傷[20]。

谷維素最初被認為是單一的化合物，之后確定為環(huán)木菠蘿醇類阿魏酸酯和甾醇類阿魏酸酯的混合物，一般被稱為α-、β-和γ-谷維素，而γ-谷維素是最常提到的。目前，已分離和鑒別的γ-谷維素有效成分達10 種[21-22]。據(jù)報道，γ-谷維素能抑制四氯化碳引起的肝脂質(zhì)過氧化，對化學性肝損傷具有預防性保護作用[23]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)γ-谷維素預處理后，明顯降低由H2O2所致L02細胞ROS的水平，CAT、SOD和GSH等活性物質(zhì)的分泌量回升，MDA含量顯著下降。表明γ-谷維素對H2O2誘導L02細胞氧化損傷具有修復作用，通過抑制脂質(zhì)過氧化，減少GSH消耗和提高抗氧化酶活性，緩解H2O2造成的氧化損傷。另據(jù)研究報道[24]，γ-谷維素能促進前列腺素E2的降解，保護由過氧化氫導致的機體損傷，能抑制NF-κB的活性同時能增加抗氧化酶的活性。γ-谷維素的抗氧化作用可能是因為它的阿魏酸基團[25]，阿魏酸是一種酚酸抗氧化劑。

隨著現(xiàn)今生活水平的提高，越來越多高脂肪食品和添加劑進入人們的生活，嚴重危害人類的健康，γ-谷維素作為植物源性的天然抗氧化劑，提高機體的抗氧化應激的能力，但其作用機理尚不清楚，值得深入研究與探討，對γ-谷維素抗氧化應激機理進一步研究，有望開發(fā)成新抗氧化劑，為深入開展氧化應激的理論研究和科學應用提供依據(jù)和探索新的途徑。

綜上所述，γ-谷維素濃度在0.05～0.5 mmol/L時無顯著細胞毒性，L02細胞經(jīng)過氧化氫處理后，細胞膜氧依賴性酶受到影響，MDA含量上升，SOD、CAT酶活性下降，GSH得不到補充，自由基清除能力下降，導致細胞內(nèi)ROS含量上升，細胞損傷。而經(jīng)過γ-谷維素預處理后，改善了細胞的增殖情況，抵御了細胞的過度脂質(zhì)過氧化，維持正常的生理形態(tài)，對細胞有良好的保護作用。

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Proliferative and Protective Effect of γ-Oryzanol on L02 Cells against Oxidative Damage Induced by Hydrogen Peroxide

JIANG Weiwei1， YI Jine1，2，*， TAN Zhuliang1，*
（1. College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；2. Hunan Co-innovation Center Production Safety， Changsha 410128， China）

Objective： To investigate the proliferative and protective effects of γ-oryzanol on L02 cells. Methods： The model of oxidative damage was established on L02 cells induced by H2O2. Cell viability， the contents of malondialdehyde （MDA）and glutathione （GSH）， the activities of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT）， and the level of ROS were assayed on L02 cells treated with γ-oryzanol at various concentrations in vitro. Results： The cell viability was enhanced significantly， and the levels of ROS and MDA were decreased significantly， whereas the content of GSH and the activities of CAT and SOD were significantly increased by 0.1-0.4 mmol/L γ-oryzanol treatment after H2O2-induced oxidative damage in a dose dependent manner. Conclusion： γ-Oryzanol can effectively attenuate H2O2-induced oxidative damage at a dose of 0.1-0.4 mmol/L and maintain the normal physiology of the cells.

γ-oryzanol； oxidative damage； L02 cell

10.7506/spkx1002-6630-201607034

S854

A

1002-6630（2016）07-0187-05

蔣維維， 易金娥， 譚柱良. γ-谷維素對過氧化氫誘導氧化損傷L02細胞的增殖和保護作用［J］. 食品科學， 2016， 37（7）：187-191. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607034. http：//www.spkx.net.cn

JIANG Weiwei， YI Jine， TAN Zhuliang. Proliferative and protective effect of γ-oryzanol on L02 cells against oxidative damage induced by hydrogen peroxide［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 187-191. （in Chinese with English abstract）DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607034. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-05

湖南省自然科學基金項目（2015JJ2077）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31201964）；教育部高校博士學科點專項基金新教師類資助項目（20124320120011）；湖南省教育廳科學研究項目（12A066）；湖南農(nóng)業(yè)大學公派出國科研啟動基金項目（14RCPT12）

蔣維維（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品保健，食品抗氧化。E-mail：weiwei13511@163.com

*通信作者：易金娥（1976—），女，教授，博士，研究方向為食品保健。E-mail：yijine@gmail.com譚柱良（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)保健。 E-mail：ztandao@gmail.com