鄭 艷，姚 婷

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

PCR-DGGE分析甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中細菌多樣性

鄭 艷，姚 婷

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

以不同發(fā)酵階段的甘薯酸漿為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳技術（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析甘薯酸漿發(fā)酵過程中細菌的多樣性。提取樣品總DNA，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rDNA的高變區(qū)序列，再通過變性梯度凝膠電泳得到特異性條帶并對其進行序列分析及比對。結果表明：甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中，主要以厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的明串珠菌屬（Leuconostoc）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Reyranella屬、泛菌屬（Pantoea）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）以及螺菌屬（Spiriiium）的細菌為主；此外，還有擬桿菌門中黃桿菌屬（Flavobacterium）以及藍細菌中的色球藻屬（Chroococci）的細菌參與其中。相似性分析結果表明，自然發(fā)酵甘薯酸漿中的菌群結構有很大相似性，其中最大相似度為88.5%，最小相似度為71.4%。

甘薯酸漿；變性梯度凝膠電泳；優(yōu)勢菌種；系統(tǒng)進化樹；絮凝微生物

作為淀粉漿自然發(fā)酵產物，甘薯酸漿因具有促進淀粉顆粒沉降，提高淀粉純度的功能，而被我國的淀粉生產企業(yè)廣泛采用[1]。大量研究表明，酸漿之所以具有絮凝淀粉的能力，主要是由于微生物的作用，但具體是哪些種屬的微生物目前尚不明確[2]。因此，了解甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中的菌群結構，對控制酸漿質量以及開發(fā)微生物絮凝劑具有重要的意義。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）常用于研究微生物群落結構，起初是用來檢測DNA片段的點突變，1993年，Muyzer[3]、Leman[4]等首次將這一技術應用于微生物群落結構的研究，并取得了顯著成效[5]。運用PCR-DGGE技術可通過免培養(yǎng)技術再現(xiàn)原始群落結構，從而避免分離培養(yǎng)方法造成的分析誤差[6-9]。采用PCR-DGGE分析甘薯酸漿的細菌多樣性的相關報道尚未見到。本實驗以不同發(fā)酵周期的甘薯酸漿為研究對象，利用PCR-DGGE技術，分析甘薯酸漿發(fā)酵過程中細菌群落變化，并結合Quantity One分析軟件以及16S rDNA序列測定等分子鑒定技術對樣品中菌群組成進行分析，確定發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種及具絮凝作用菌，并通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析樣品間菌群的親緣關系[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮甘薯購自沈陽農業(yè)大學馬官橋農貿市場。

Taq DNA聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；去離子甲酰胺 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；四甲基二乙胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、雙丙烯酰胺 美國Sigma公司；過硫酸銨 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀 德國Biometra公司；DGGE儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯酸漿的制備

參照鄧福明[10]的方法，將甘薯洗凈去皮后切成小塊，按m（甘薯）∶V（水）=1∶3粉碎，漿液過80目篩，除去細小薯渣。在過濾后的淀粉乳中，加入1/3淀粉乳（V/V）的酸漿后立即攪拌、靜置，待淀粉沉淀完全后將黑粉層以上的渾濁廢渣倒掉。乳液在25 ℃條件下發(fā)酵，每12 h攪拌2 min。每隔24 h取樣一次，每次2 個重復，連續(xù)取樣5 d，樣品編號分別為1、2、3、4、5。

1.3.2 總DNA的提取

采用Mobil DNA Isolation Kit提取樣品總DNA[11]，在2 mL離心管中加入1 mL甘薯酸漿發(fā)酵液，1 000hg離心2 min，棄去上清液；檢查S1溶液是否有沉淀，若有，使用前加熱到60 ℃使之溶解。向上述離心管中的沉淀加入60 μL S1溶液，漩渦混合；再加入200 μL IRS溶液充分漩渦10 min，將離心管在1 000hg下離心30 s，將上清液轉移至另一干凈的收集管中；向收集管中加入250 μL S2溶液，漩渦振蕩5 s。4 ℃條件下靜置5 min后1 000hg離心1 min，將上清轉移到新的收集管中；向收集管中加1.3 mL搖勻的S3溶液，漩渦5 s；將溶液轉移至Spin Filter 1 000hg離心1 min，將殘留的清液再次加入到Spin Filter中1 000hg離心1 min。重復這一過程，直至所有的上清液都通過Spin Filter。向清液中加入300 μL S4溶液，1 000hg離心30 s；棄掉上層洗滌流出液，再1 000hg離心1 min，小心地將Spin Filter放入新的2 mL收集管中；向收集管中加入500 μL S5溶液至Spin Filter的中央，1 000hg離心30 s，棄掉Spin Filter，試管中的DNA在－20 ℃條件下保存。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴增

采用細菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。引物序列[12]見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴增體系（50 μL）：10hPCR Buffer 5 μL；dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；GC-338F（20 μmol/L）1 μL；518R（20 μmol/L）1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

PCR產物采用DNA凝膠提取試劑盒純化回收[13]。

1.3.4 擴增片段的變性梯度凝膠電泳

取10 μL PCR的產物進行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、質量分數(shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠在1hTAE緩沖液中150 V、60 ℃條件下電泳5 h。

DGGE完畢后，采用銀染法染色[14-15]：倒掉去離子水，加入固定液固定15 min后用超純水清洗凝膠2 次。再加入500 mL銀染液染色15 min。然后用超純水清洗2 次。之后加入500 mL顯色液對凝膠顯色5～7 min。顯色完成后用終止液停止反應。

1.3.5 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶，采用多凝膠DNA提取試劑盒回收目的條帶[15]。以2 μL回收產物為模板，338F/518R為引物進行PCR擴增。

PCR擴增體系和PCR擴增程序與1.3.3節(jié)相同。將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，進行序列測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

細菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)以及均勻度的綜合指標，其中香農指數(shù)（H）、豐度（S）和均勻度（E）被用來比較不同樣品的多樣性情況。采用Quantity One軟件，根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度（灰度），對H、E和S進行分析[16]，來比較不同樣品的多樣性情況。H、E按下列公式計算。

式中：pi為樣品中每一條帶在該樣品所有條帶中的強度比；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐富度；Ni為第i條帶的豐度；S為該樣品中所有條帶數(shù)目總和。

測序結果采用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件，Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（bootstrap）為1 000。

2 結果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增結果

圖1 發(fā)酵1～5 d樣品DNA凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from samples fermented for 1-5 days

采用試劑盒法提取發(fā)酵1～5 d的酸漿樣品DNA后，經2%瓊脂凝膠電泳得到電泳圖。由圖1可知，提取的DNA條帶較亮，提取效果較好，可用于后續(xù)實驗。

2.2 細菌16S rDNA的PCR擴增結果

圖2 16S rDNA片段PCR擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products

由圖2可知，發(fā)酵酸漿細菌總DNA進行16S rDNA序列擴增后得到約200 bp的DNA片段，可用于DGGE分析。

2.3 PCR產物的DGGE結果

圖3 PCR產物的DGGE圖Fig.3 DGGE electrophoresis

由圖3可知，不同發(fā)酵周期的甘薯酸漿經過PCRDGGE電泳分析后，分離出數(shù)目不等的電泳條帶，且各條帶的強度和遷移率各不相同。

2.4 Quantity One 分析

圖4 量化分析膠圖Fig.4 Quantitative analysis of gels

采用Quantity One軟件對2.3節(jié)中的電泳條帶進行匹配分析。由圖4可知共獲得16 類條帶。在獲得的16 類條帶中，5、6、10、15、16號均顯示為優(yōu)勢條帶（DGGE圖譜量化后較寬較深），9、12、13號被視為特征條帶（某個樣品中特有），將這些條帶均進行割膠回收分析。

2.5 不同發(fā)酵時間甘薯酸漿PCR-DGGE圖譜相似度分析

對照條帶的強度與遷徙程度，根據(jù)戴斯系數(shù)（dicecoefficient，Cs）計算出樣品間相似度的矩陣圖。由表2可知，樣品間的最大相似度為88.5%，最小相似度為71.4%。說明發(fā)酵期間的菌群結構相似度較高。

表2 PCR-DGGE圖譜的相似性比較結果Table 2 Comparison of PCR-DGGE profiles for similarity with dice coefficient %

利用相似性矩陣數(shù)據(jù)，通過UPGAMA（the unweighted pair group method with arithmetic averages）算法可實現(xiàn)聚類分析，生成系統(tǒng)樹，如圖5所示。

圖5 樣品聚類分析圖Fig.5 Dendrogram （UPGMA） among 1-5 samples

2.6 不同發(fā)酵時間甘薯酸漿細菌多樣性

由Quantity One軟件輸出各樣品各條帶的灰度值，利用Biodap計算出樣品間的香農指數(shù)、均勻度和豐度。結果如圖6所示。

圖6 細菌多樣性指數(shù)柱狀圖Fig.6 Diversity analysis of bacteria from sweet potato sour liquid during the fermentation period

分析結果表明，甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中細菌多樣性顯著，分布較為均勻。其中，發(fā)酵3 d的甘薯酸漿細菌香農指數(shù)可達2.53，豐度指數(shù)可達14，均勻度指數(shù)可達0.96，這與DGGE圖譜（圖3）的結果一致。

2.7 主要電泳條帶的序列鑒定和同源性分析

對DGGE電泳所得16 條特異性條帶切膠回收，以338F/518R為引物進行PCR擴增，獲得約200 bp的DNA片段。PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上，轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆測序。

登陸美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網站，測序結果與GenBank中的序列進行比對，得到條帶所代表的細菌類型。每個回收條帶選取3 個克隆進行了序列測定，比對結果見表3。

表3 序列鑒定和同源性分析結果Table 3 Sequence identification and homology analysis

圖7 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree

結果表明，所有序列與數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列的相似度在91%～100%之間。采用MEGA5軟件，Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7所示，進行同源性分析，判斷它們的親緣關系[18-20]，自展數(shù)（bootstrap）為1 000。

由圖7可知，根據(jù)進化上親緣關系的相似度，條帶1、2、5、6、7、8、9、15序列形成了第1類群；條帶3、4、10、11、13、14、16形成了第2類群；條帶12為第3類群。

3 結 論

甘薯酸漿是酸漿法生產淀粉、粉絲過程中促使淀粉顆粒聚集成團，促進淀粉絮凝，并且能夠提高淀粉純度的一種生物絮凝劑[2]，是由新鮮的甘薯淀粉乳經自然發(fā)酵后形成的一種具有微酸性的乳白色液體。我國對甘薯酸漿的研究相對較多，主要集中在甘薯酸漿工藝優(yōu)化，對甘薯酸漿中的微生物計數(shù)、分離提取。利用PCR-DGGE分析甘薯酸漿發(fā)酵過程中的細菌多樣性還未見報道[11]。

PCR-DGGE是研究微生物菌群結構的主要方法之一[21-23]。本研究采用PCR-DGGE法對自然發(fā)酵過程中甘薯酸漿的細菌多樣性進行分析，根據(jù)得到的16 條條帶將甘薯酸漿中的微生物進行歸類。結果表明：在甘薯酸漿發(fā)酵過程中共鑒定出7 個細菌菌屬，主要以厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的細菌為主；厚壁菌門以Leuconostoc為主，而變形菌門則以Acinetobacter、Reyranella、Pantoea、Cronobacter以及Spiriiium為主；此外，還有擬桿菌門中Flavobacterium以及藍細菌中的Chroococci。這與洪安安[24]于2009年研究活性污泥中絮凝菌群的結果一致。

在甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中，細菌菌群群落結構也有變化，Leuconostoccitreum KM20、Leuconostoc mesenteroides、Acinetobacter lwoffii、Reyranella graminifolii、Pantoea eucalypti、Cronobacter dublinensis、Chroococci diopsisthermalis、Niveispirillum irakense在整個發(fā)酵過程中都有出現(xiàn)，Niveispirillum irakense數(shù)量在整個發(fā)酵過程中先隨著發(fā)酵時間的延長增多，發(fā)酵中期過后又逐漸減少，可以推測它對絮凝起到重要作用。F. oncorhynchi只出現(xiàn)在發(fā)酵中期，此時甘薯酸漿絮凝性最高，可以判斷為具有絮凝作用菌。這種細菌具有良好的絮凝效果，這在王兆慧[25]產絮凝劑黃桿菌的篩選及絮凝特性研究中得到了驗證。

[1] 曹宗巽, 盧光瑩. 乳酸鏈球菌凝集淀粉粒機理的進一步研究[J].微生物學報, 1980, 20(3): 271-275. DOI:10.13343/j.cnki. wsxb.1980.03.008.

[2] 張莉力, 李新華. 甘薯酸漿絮凝淀粉機理及人工發(fā)酵劑制備酸漿的工藝研究[D]. 沈陽: 沈陽農業(yè)大學, 2010: 18-21.

[3] MUYZER G, WAAL E C, UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695-700.

[4] LEMAN L, FISCHER S, HURLEYI, et al. Sequence-determined DNA separations[J]. Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 1984, 13(1): 399-423. DOI:10.1146/annurev.bb.13.060184.002151.

[5] ABRIOUELH, BENOMAR N, LUCAS R, et al. Culture-independent study of the diversity of microbial populations in brines during fermentation of naturally-fermented Alore?a green table olives[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 144(3): 487-496. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.11.006.

[6] 武俊瑞. 東北傳統(tǒng)發(fā)酵特色食品中主要微生物多樣性研究[D]. 沈陽: 沈陽農業(yè)大學, 2013: 25-30.

[7] 許文濤, 郭星, 羅云波, 等. 微生物菌群多樣性分析方法的研究進展[J]. 食品科學, 2009, 30(7): 258-265. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.07.060.

[8] 朱揚玲. 采用PCR-DGGE方法研究浙江玫瑰醋釀造過程中的微生物多樣性[D]. 杭州: 浙江工商大學, 2009: 41-43.

[9] Lü X C, WENG X, ZHANG W, et al. Microbial diversity of traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine as determined by PCR-mediated DGGE[J]. Food Control, 2012, 28(2): 426-434. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.05.025.

[10] 鄧福明. 酸漿法與旋流分離法制備甘薯淀粉的物化特性及粉條品質比較研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2012: 15-18.

[11] SADET S, MARTIN C, MEUNIER B, et al. PCR-DGGE analysis reveals a distinct diversity in the bacterial population attached to the rumen epithelium[J]. Animal, 2007, 51(1): 939-944. DOI:10.1017/ S1751731107000304.

[12] FAHLE G A, FISCHER S H. Comparison of six commercial DNA extraction kits for recovery of cytomegalovirus DNA from spiked human specimens[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38(10): 3860-3863.

[13] HARUTA S, UENO S, EGAWA I, et al. Succession of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice viengar assessed by PCR-DGGE[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 109(1): 79-87. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.01.015.

[14] 姚粟. 芝麻香型白酒高溫大曲細菌群落多樣性研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學, 2013: 34-37.

[15] NIEMI R M, HEISKANMEN I, WALLENIUS K, et al. Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE analysis of bacterial consortia[J]. Journal of Microbiological Methods, 2001, 45(3): 155-165. DOI:10.1016/S0167-7012(01)00253-6.

[16] KUANG Y, TANI K, AIDAN J, et a1. Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastits by culture-independent PCR-DGGE method[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 45(4): 76-81. DOI:10.1016/j.bej.2009.02.010.

[17] 馬俊孝, 季明杰, 孔健. PCR-DGGE技術在微生物物種多樣性研究中的局限性及其解決措施[J]. 食品科學, 2008, 29(5): 493-497. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.05.112.

[18] YU Z T, MORRISON M. Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-DGGE[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(8): 4800-4806. DOI:10.1128/AEM.70.8.4800-4806.2004.

[19] 李正國, 付曉紅, 鄧偉, 等. 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結合DGGE法檢測榨菜腌制過程的細菌多樣性[J]. 微生物學通報, 2009(3): 371-376.

[20] 楊代永, 范光先, 汪地強, 等. 高溫大曲中的微生物研究[J]. 釀酒科技, 2007(5): 37-38. DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2007.05.006.

[21] ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56(3): 297-314. DOI:10.1016/j.mimet.2003.11.006.

[22] 張春林. 內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸粥中微生物多樣性分析[D]. 呼和浩特:內蒙古農業(yè)大學, 2010: 54-57.

[23] WANG H Y, ZHANG X J, ZHAO L P, et al. Analysis and comparison of the bacterial community in fermented grains during the fermentation for two different styles of Chinese liquor[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2008, 35(5): 603-609. DOI:10.1007/ S10295-008-0323-z.

[24] 洪安安. 活性污泥的主要微生物菌群及研究方法[J]. 工業(yè)水處理, 2009, 29(2): 10-14. DOI:10.11894/1005-829x.

[25] 王兆慧. 產絮凝劑黃桿菌的篩選及其絮凝特性研究[J]. 安徽農業(yè)科學, 2009, 37(35): 17327-17332. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2009.35.013.

Analysis of Bacterial Diversity during Natural Fermenation of Sweet Potato Sour Liquid by PCR-DGGE

ZHENG Yan, YAO Ting
(Food Science College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

In the present study, changes in the bacteria composition of sweet potato sour liquid during the natural fermentation process were investigated by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Total bacterial DNA was extracted from the samples, and the touch down PCR was applied to amplify the V3 region of 16S rDNA for identification based on DGGE fingerprints. The specific gel bands were excised， then sequenced and analyzed by comparison with the GenBank database. Results showed that the representative bacteria during the fermentation process of sour liquid were identified as Leuconostoc, Acinetobacter, Reyranella, Pantoea, Cronobacter, Spiriiium which belong to Firmicutes and Proteobacteria, respectively. Flavobacterium belonging to the phylum Bacteroidetes and Chroococci belonging to the phylum Cyanobacteria were also involved. The coefficient of similarity showed that the similarity of bacterial community in sweet potato sour liquid ranged from 88.5% to 71.4%.

sweet potato sour liquid; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); dominant bacteria; phylogenetic tree; flocculent microorganisms

10.7506/spkx1002-6630-201607019

TS201.3

A

1002-6630（2016）07-0099-05

鄭艷, 姚婷. PCR-DGGE分析甘薯酸漿自然發(fā)酵過程中細菌多樣性[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 99-103. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607019. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Yan, YAO Ting. Analysis of bacterial diversity during natural fermenation of sweet potato sour liquid by PCRDGGE[J]. Food Science, 2016, 37(7): 99-103. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607019. http://www.spkx.net.cn

2015-04-27

鄭艷（1973—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物學及食品生物技術。E-mail：23574196@qq.com