莫俊杰，梁鉀賢，胡漢橋，黃 紅，陳 妤

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江　524088）

芋頭過氧化物酶基因克隆

莫俊杰，梁鉀賢，胡漢橋，黃 紅，陳 妤

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江524088）

根據(jù)芋頭的密碼子使用頻率，用 iCODEHOP 設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因序列，待芋頭過氧化物酶基因非側(cè)翼序列擴(kuò)增成功后，依據(jù)其序列合成 hiTAIL-PCR 引物擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因的兩側(cè)序列。結(jié)果從芋頭基因組DNA中克隆出 1 165 bp序列，經(jīng)同源性分析為過氧化物酶基因的部分序列；再利用hiTAIL-PCR技術(shù)可以擴(kuò)增出芋頭過氧化物酶基因的兩側(cè)序列，擴(kuò)增序列為 689 bp，測序結(jié)果能與1 165 bp序列拼接到一起，長1 854 bp。與已知的過氧化物酶進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)兩側(cè)還有氨基酸的編碼序列，因此進(jìn)行第2次hiTAIL-PCR，擴(kuò)增出165 bp芋頭過氧化物酶基因的側(cè)翼序列，拼接后得到2 019 bp。用Softberry上的基因預(yù)測軟件分析后，發(fā)現(xiàn)包含過氧化物酶4個(gè)外顯子，同源性分析表明，此過氧化物酶基因?yàn)楹t素的第三類過氧化物酶。

芋頭；過氧化物酶基因；hiTAIL-PCR；克隆

莫俊杰，梁鉀賢，胡漢橋，等. 芋頭過氧化物酶基因克?。跩］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（9）：37-43.

芋頭（Colocasia esculenta）主要種植于熱帶地區(qū)，在東南亞和太平洋地區(qū)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。2016年國際糧農(nóng)組織報(bào)告，2004—2014年期間，我國的芋頭年均生產(chǎn)量居全球第2位，僅次于尼日利亞。然而，芋疫病是芋頭生產(chǎn)中的重要病害［1-2］。該病流行性強(qiáng)，破壞性大，主要為害葉片，也為害葉柄及塊莖。大量研究表明，過氧化物酶活性與植物的抗病性具有正相關(guān)關(guān)系［3］。因此，揭示芋頭耐逆的分子機(jī)理、克隆與逆境脅迫相關(guān)的重要功能基因?qū)τ箢^耐逆性和廣適應(yīng)性的基因工程改良及擴(kuò)大芋頭生產(chǎn)具有重要意義。

獲得一個(gè)新基因的方法很多，多數(shù)是采用建立文庫的方法來篩選，但從文庫中篩選一個(gè)特定的基因比較困難。從細(xì)菌中構(gòu)建的DNA文庫至少有數(shù)萬個(gè)克隆，如何從眾多克隆中獲得目的基因，始終是DNA文庫篩選工作的一個(gè)難點(diǎn)。雖然有許多有效的篩選方法，但仍未能真正克服文庫篩選工作量大的問題?，F(xiàn)代生物信息學(xué)飛速發(fā)展，很好地解決了這一難題［4］。通過在GenBank中查詢與目的基因相關(guān)的序列，找出其保守區(qū)。據(jù)此設(shè)計(jì)出簡并引物，從而快速地克隆出目的基因片段。事實(shí)證明，CODEHOPs（Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers）是鑒定新基因的非常有效的方法［5-6］，而且利用iCODEHOP在線設(shè)計(jì)簡并引物非常方便［7-8］。

TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）是建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的染色體步移技術(shù)，為擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知DNA片段提供了捷徑［9］。該技術(shù)以基因組DNA為模板，使用高退火溫度的長特異引物和低退火溫度的短簡并引物，通過特殊的熱不對稱（高嚴(yán)謹(jǐn)性PCR和低嚴(yán)謹(jǐn)性PCR交替）循環(huán)程序，有效擴(kuò)增特異產(chǎn)物。該技術(shù)具有簡單快速、特異性高、分離出的DNA序列可以用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制和直接測序等優(yōu)點(diǎn)，近年來，被分子生物學(xué)研究者廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究中非常實(shí)用的基因側(cè)翼序列克隆技術(shù)［10-11］，同時(shí)在植物基因克隆方面也取得了很大進(jìn)展。

hiTAIL-PCR（high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR）是 TAIL-PCR進(jìn)一步改良的方法，它能夠阻止非目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增和抑制小目標(biāo)產(chǎn)物，但是允許大目標(biāo)序列的有效擴(kuò)增。經(jīng)測試，反應(yīng)的成功率超過90%，在大多數(shù)情況下獲得的主要產(chǎn)物片段為1～3 kb［12］。hiTAIL-PCR技術(shù)非常實(shí)用［13-16］。例如，郭翠等［14］通過一次hiTAIL-PCR和一次長鏈PCR擴(kuò)增方法獲得了轉(zhuǎn)抗草甘膦基因玉米品系D-3的外源DNA插入片段的全DNA序列及兩端側(cè)翼序列，并建立了轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法；趙靜等［15］以海州香薷基因組DNA為模板，通過hiTAIL-PCR和walking技術(shù)擴(kuò)增得到其細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子片段，長度為1 727 bp；廖小芳等［16］利用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增紅麻cox1全長及側(cè)翼序列，結(jié)果表明，在紅麻不育系UG93A和保持系UG93B中分別獲得長度為2 149、3 244 bp的序列，包含cox1基因CDS全長及其5′和3′部分側(cè)翼序列。然而，Zhou等［17］認(rèn)為，hiTAIL-PCR還需改進(jìn)，因?yàn)樵趆iTAIL-PCR中擴(kuò)增出許多非特異性產(chǎn)物，而沒有為下游分析生成足夠的產(chǎn)物。由此他們修改了hiTAIL-PCR程序和重新設(shè)計(jì)了隨機(jī)引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)修改后的hiTAIL-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性都得到了提高，用來鑒定由 phiC31整合酶調(diào)控的基因組整合部位更加精確和有效。

采用hiTAIL-PCR技術(shù)，已有大量植物功能基因被成功克隆。然而與芋頭逆境脅迫相關(guān)的重要功能基因的克隆卻鮮有報(bào)道。目前芋頭過氧化物酶在NCBI中只有1個(gè)300 bp左右的EST（expressed sequence tags）序列，同源分析表明它與其他物種的過氧化物酶基因序列最大的一致性只有80%。因此不能用其他物種的過氧化物酶序列作為參考直接設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增。本研究根據(jù)芋頭的密碼子使用頻率采用iCODEHOP設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因序列，然后采用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增該基因的兩側(cè)序列，為進(jìn)一步了解芋頭過氧化物酶基因家族的功能及其分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究芋頭抗疫病的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

芋頭抗疫病品種湛江-5、感病品種湛江-4來源于廣東省湛江市農(nóng)家栽培品種。DNA回收試劑盒（TAKARA公司TaKaRa AgaroseGelDNAPurification Kit Ver.2.0）、pMD-18T 載體試劑盒（TAKARA公司）、PCR儀（美國BIORAD公司）、電泳儀（北京六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1芋頭過氧化物酶基因非側(cè)翼序列擴(kuò)增 采用改進(jìn)的CTAB法提取芋頭基因組DNA，調(diào)整DNA濃度至20 ng/μL。根據(jù)芋頭的密碼子使用頻率用iCODEHOP 設(shè)計(jì)擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因序列的簡并引物（表1）。

表1　擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因非側(cè)翼序列引物

PCR反應(yīng)體系（60 μL）如下：19.5 μL滅菌雙蒸水，30 μL 2×MightyAmp 緩沖液，1.5 μL MightyAmpDNA聚合酶，6.0 μL引物混合液（按等體積混合 10 μmol/L A1和C12、A1和C16、A2 和C12、A2和C16 前導(dǎo)引物和隨后引物），3.0 μL芋頭DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下：98℃ 2 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、68℃ 2 min，40 個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min。取 5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后取剩余的擴(kuò)增陽性的反應(yīng)液用DNA回收試劑盒回收DNA。再取回收的DNA用 pMD-18T 載體試劑盒進(jìn)行連接，連接過夜后用 CaCl2轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將涂抹轉(zhuǎn)化菌液后的平皿倒置于37℃培養(yǎng) 12～16 h，挑選白色菌落（含重組質(zhì)粒）進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行重組子鑒定。最后，將擴(kuò)增陽性的反應(yīng)液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2芋頭過氧化物酶基因兩側(cè)序列擴(kuò)增 待芋頭過氧化物酶基因序列擴(kuò)增成功后，依據(jù)其序列合成 hiTAIL-PCR引物（表2）。hiTAILPCR分 3 輪進(jìn)行。第 1 輪反應(yīng)用 20 μL反應(yīng)體系：5.9 μL滅菌雙蒸水，10.0 μL 2×MightyAmp緩沖液，2.0 μL LAD1-1（LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4）引物，0.6 μL POD-0a（POD-0b）引物，0.5 μL MightyAmpDNA聚合酶，1.0 μL芋頭DNA模板。第 2 輪反應(yīng)用25 μL反應(yīng)體系：18.18 μL滅菌雙蒸水，2.50 μL 10×ExTaq 緩沖液，2.00 μL dNTP 混合液，0.60 μL AC1 引物，0.60 μL POD-1a（POD-1b）引物，0.12 μL ExTaq 酶，1.00 μL稀釋 40 倍的第 1 輪PCR產(chǎn)物。第 3 輪反應(yīng)用 25 μL反應(yīng)體系：18.2 μL滅菌雙蒸水，2.5 μL 10×ExTaq 緩沖液，2.0 μL dNTP 混合液，0.6 μL AC1 引物，0.6 μL POD-2a（POD-2b）引物，0.1 μL ExTaq酶，1.0 μL稀釋10倍的第2輪PCR產(chǎn)物。hiTAIL-PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［12］的方法并作出相應(yīng)修改（表3）。3輪PCR反應(yīng)完后，其產(chǎn)物同1.2.1進(jìn)行檢測、回收、連接、轉(zhuǎn)化、再檢測、送公司測序。

表2　hiTAIL-PCR引物

2　結(jié)果與分析

2.1芋頭過氧化物酶基因非側(cè)翼序列擴(kuò)增

利用 iCODEHOP 設(shè)計(jì)的簡并引物可以從芋頭抗疫病品種湛江-5和感病品種湛江-4的基因組DNA中擴(kuò)增出芋頭過氧化物酶基因序列，其中以芋頭抗疫病品種湛江-5 DNA為模板的擴(kuò)增效果更明顯，擴(kuò)增所得序列約1 000 bp（圖1）。利用DNA回收試劑盒回收，得到的芋頭過氧化物酶基因序列為100 ng/μL，可以進(jìn)行下一步連接、轉(zhuǎn)化。經(jīng)重組子鑒定后，將擴(kuò)增陽性的反應(yīng)液送公司測序，結(jié)果表明成功地從芋頭基因組DNA中克隆出 1 165 bp序列，經(jīng)同源性分析為過氧化物酶基因的部分序列。

表3　hiTAIL-PCR反應(yīng)條件

圖1　芋頭過氧化物酶基因非側(cè)翼序列擴(kuò)增檢測

圖2　hiTAIL-PCR擴(kuò)增檢測

2.2芋頭過氧化物酶基因兩側(cè)序列擴(kuò)增

利用hiTAIL-PCR技術(shù)可以擴(kuò)增出芋頭過氧化物酶基因的兩側(cè)序列（圖2）。用DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，于37℃培養(yǎng) 12～16 h，挑選白色菌落（含重組質(zhì)粒）進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行重組子鑒定，確定轉(zhuǎn)化的菌落里含有目的基因（圖3）。經(jīng)測序并刪減與上述1 165 bp片段重復(fù)的序列后，確定所擴(kuò)增出來的芋頭過氧化物酶基因的兩側(cè)序列為689 bp。芋頭過氧化物酶基因1 165 bp序列加上兩側(cè)序列后為1 854 bp。與已知的過氧化物酶進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)兩側(cè)還有氨基酸的編碼序列，因此進(jìn)行了第2次hiTAIL-PCR。而第2次hiTAIL-PCR又?jǐn)U增出來 165 bp芋頭過氧化物酶基因的側(cè)翼序列，與之前得到的1 854 bp序列拼接后為2 019 bp。用Softberry上的基因預(yù)測軟件分析后，發(fā)現(xiàn)包含過氧化物酶4個(gè)外顯子（圖4）。

圖3　菌落PCR結(jié)果

同源性分析表明，此過氧化物酶基因?yàn)楹t素的第三類過氧化物酶。再次與已知的過氧化物酶進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，兩側(cè)還有氨基酸的編碼序列。因此進(jìn)行第3次hiTAIL-PCR，擴(kuò)增出了DNA片段，但在克隆時(shí)遇到了一定困難，多次試驗(yàn)后仍未成功。

圖4　拼接分析結(jié)果

3　討論

PCR最初是為擴(kuò)增已知序列設(shè)計(jì)的，后來發(fā)展的簡并PCR技術(shù)卻能擴(kuò)增未知序列。當(dāng)待研究的基因序列不明，僅知其一部分氨基酸序列，即可根據(jù)氨基酸序列合成一組簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對基因家族中的未知成員（基因）進(jìn)行分離。簡并PCR與常規(guī)PCR之間的一個(gè)重大差別，是用簡并引物代替具有特定序列的特異PCR引物。簡并引物的出現(xiàn)是由于遺傳密碼具有簡并性，這樣可以根據(jù)氨基酸的保守序列反推到DNA水平設(shè)計(jì)引物。由于大多數(shù)氨基酸的遺傳密碼不止一種，因此引物的部分堿基不能確定?？梢愿鶕?jù)各種不同的遺傳密碼規(guī)律設(shè)定DNA和氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)換，這樣設(shè)計(jì)出來的引物是將可能編碼一個(gè)給定氨基酸序列的核苷酸組合設(shè)計(jì)為一組，實(shí)際上是多種序列的混合物，序列的大部分是相同的，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡并引物［18］。其實(shí)，簡并PCR一直是尋找和發(fā)現(xiàn)“新”基因或基因家族新成員的一種非常有用的工具［4］。李運(yùn)合等［19］利用 CODEHOP 和 iCODEHOP 設(shè)計(jì)了8對簡并引物，從芒果子葉中擴(kuò)增到了8條不同長度的 cDNA片段，測序結(jié)果表明，這些片段包含4類不同DNA序列。經(jīng)過在 NCBI 上進(jìn)行BLASTx分析，這些序列與其他植物的 LAX 基因具有高度同源性。研究結(jié)果表明，CODEHOP和 iCODEHOP設(shè)計(jì)的簡并引物可信性強(qiáng)并具有高效性。王龍等［20］通過 iCODEHOP 在線設(shè)計(jì)細(xì)菌通透酶的簡并引物，以發(fā)酵黃芪菌 FGM 基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到740 bp PCR產(chǎn)物。序列通過 BLASTx 檢索與 GenBank 進(jìn)行同源性比對后，結(jié)果表明，此DNA產(chǎn)物序列與其他菌屬來源的通透酶蛋白序列具有相似性，所克隆的序列即為 FGM 通透酶基因片段。由此認(rèn)為，用 iCODEHOP 在線設(shè)計(jì)的簡并引物可信性強(qiáng)，陽性率高。崔文明等［21］利用 ICO-DEHOP和 CODEHOP 在線簡并引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)β-Hexcase 簡并引物，以 LJJ 基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到 614 bp 產(chǎn)物。該DNA序列經(jīng)BLASTx比對發(fā)現(xiàn)與其他已知 β-Hexcase 基因具有相似性，表明所克隆的序列即為 LJJβ-Hexcase基因片段。

本試驗(yàn)用 iCODEHOP 設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增芋頭過氧化物酶基因序列，并用 hiTAIL-PCR技術(shù)進(jìn)一步對芋頭過氧化物酶基因的兩側(cè)序列進(jìn)行了擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出了大小為 2 019 bp 的芋頭過氧化物酶基因序列，該序列包含過氧化物酶4個(gè)外顯子。同源性分析表明，此過氧化物酶基因?yàn)楹t素的第三類過氧化物酶。第三類過氧化物酶為典型的植物過氧化物酶，來源于高等植物的分泌型過氧化物酶，參與多種不同的生理功能［22］，如細(xì)胞壁合成、組織愈傷、生長素合成與代謝，與超氧化物歧化酶相互協(xié)調(diào)配合清除過剩的自由基，使植物體內(nèi)的自由基維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)的正常水平，以提高植物的抗逆性等。本研究克隆了芋頭含血紅素的第三類過氧化物酶基因序列，為芋頭抗逆性的基因工程改良提供了一定的參考，但還需要對其組織表達(dá)和芋頭植株抗疫病響應(yīng)特征進(jìn)行分析，同時(shí)還有必要利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對該基因的功能作進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Cloning of peroxidase gene in taro

MO Jun-jie，LIANG Jia-xian，HU Han-qiao，HUANG Hong，CHEN Yu（College of Agronomy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The taro peroxidase gene sequence was amplified using degenerate primers which were designed by iCODEHOP according to the taro codon usage frequency. And the peroxidase gene non-flanking sequence was amplified successfully. Then the peroxidase gene flanking sequences were amplified by hiTAIL-PCR primers which were designed on the basis of the non-flanking sequence. As a result，1 165 bp sequences were successfully cloned from taro genomic DNA，and it was affirmed that they were part of the sequences of peroxidase gene by homology analysis. Then by hiTAIL-PCR technology，the peroxidase gene flanking sequences were amplified，and 689 bp sequences were amplified. The Sequencing result could be splicedtogether with the 1 165 bp sequences. And the amplified taro peroxidase gene sequences splicedtogether with its flanking sequences were 1 854 bp. Sequence alignment with known peroxidase，we found that there were amino acid coding sequences on both sides of the amplification sequences. So，the hiTAIL-PCR technology was used as the second time，and 165 bp sequences were amplified. Splicedtogether with the 1 854 bp sequences，the amplified taro peroxidase gene sequences were 2 019 bp. With the gene on softberry prediction software analysis，it was found that the sequences contained 4 peroxidase exons. Homology analysis showed that the peroxidase gene was Class III heme-containing peroxidase.

taro；peroxidase gene；hiTAIL-PCR；cloning

S632.3；Q781

A

1004-874X（2016）09-0037-07

2016-06-21

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)子課題分項(xiàng)目（200903017-08）

莫俊杰（1980-），男，博士，助理研究員，E-mail：104750343@qq.com

胡漢橋（1968-），男，博士，教授，E-mail：huhanqiao@sina.com