徐　進(jìn)，許景升，張　昊，馮　潔，顧　鋼

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州 350003）

煙草品種青枯病抗性的組培苗接種鑒定方法研究

徐進(jìn)1，許景升1，張昊1，馮潔1，顧鋼2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州 350003）

由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是制約我國煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。選育抗病品種是防控該病最經(jīng)濟(jì)有效的策略。為探尋快速評價(jià)煙草品種青枯病抗性的方法，以6個抗感水平差異顯著的煙草品種試管苗為研究對象，采用浸根接種法，評價(jià)了室內(nèi)快速鑒定方法的可行性。結(jié)果顯示，以濃度為3×106cfu/mL的青枯菌體懸液接種21 d后，紅花大金元、翠碧1號、云煙85、K326、G80和巖煙97的病情指數(shù)分別為100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8，各品種試管苗的病情指數(shù)與田間自然發(fā)病情況呈明顯正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.936，達(dá)極顯著水平。由此可見，室內(nèi)無菌苗接種法能正確反映出不同煙草品種對青枯病的抗性水平，可作為快速、可靠評價(jià)煙草品種抗性水平的初篩手段。

煙草品種；青枯病抗性；試管苗

植物細(xì)菌性青枯?。˙acterial wilt of plants），是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，簡稱青枯菌）引起的一種世界性重大病害[1]。由青枯菌1號小種引起的煙草青枯病，于1880年在美國北卡羅萊納那州的格蘭維爾首次被報(bào)道，因此其又被稱為格蘭維爾萎蔫?。℅ranville wilt）[2]。煙草青枯病在我國南方煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺灣、湖南、四川、貴州及廣西危害最為嚴(yán)重，2008年全國煙草行業(yè)因青枯菌1號小種造成的烤煙產(chǎn)值損失高達(dá)1.15億元[3]。

由于青枯菌特別是其1號小種寄主范圍廣泛，菌系變異類型較多，侵染來源復(fù)雜，且迄今為止尚無經(jīng)濟(jì)有效的化學(xué)農(nóng)藥可用于防治，因此青枯病被公認(rèn)是一種難以控制的土傳細(xì)菌病害[4]。

選育抗病品種是防控青枯病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。傳統(tǒng)煙草品種的青枯病抗性鑒定方法包括：網(wǎng)室接種、人工病圃和大田自然病圃法。福建煙區(qū)也一直沿用傳統(tǒng)的田間人工病圃灌根法進(jìn)行煙草品種抗性鑒定，該方法雖在青枯病抗性資源鑒定評價(jià)和新品種選育方面卓有成效，但鑒定周期較長，通常需要花費(fèi)整個生產(chǎn)季節(jié)，增加了資源評價(jià)成本，降低了品種選育效率。

國外相關(guān)研究以無菌組培苗為受體材料，分別成功地評價(jià)了不同香蕉品種對黃單胞菌萎蔫?。╔anthomonas campestris pv. musacearum）、黑條葉斑?。∕ycosphaerella fijiensis Morelet）和巴拿馬?。‵usarium oxysporum f. sp. cu-bense (Foc)）的抗性水平，并揭示出該評價(jià)方法與田間評價(jià)獲得的結(jié)果具有顯著的相關(guān)性[5-7]。

迄今為止，國內(nèi)外尚無利用煙草組培苗接種法作為煙草青枯病品種抗性快速評價(jià)的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探尋組培苗接種法用于評價(jià)煙草品種青枯病抗性水平的可行性，并探究其與大田篩選鑒定結(jié)果的相關(guān)性，以期建立簡捷可靠、高通量的室內(nèi)煙草品種青枯病抗性評價(jià)體系。

1　材料與方法

1.1供試菌株材料

分別挑取室溫條件下保存于滅菌去離子水中的各青枯菌株材料（表1），于TZC培養(yǎng)平板上劃線，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑取典型的青枯菌野生型菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證陽性后，轉(zhuǎn)至普通NA培養(yǎng)平板，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

采用比濁法，挑取各純培養(yǎng)物，分別于滅菌去離子水中配置成濃度為3×108cfu/mL的細(xì)菌懸浮液；分別取各菌體懸浮液30 mL，采用傷根法接種單株4～6葉齡的福建煙區(qū)主栽高感品種紅花大金元盆栽苗，觀察各菌株致病情況。并根據(jù)發(fā)病結(jié)果，選定接種表現(xiàn)強(qiáng)毒力的青枯菌株作為隨后抗性篩選評價(jià)的接種體材料。

1.2供試植物材料

分別將供試煙草品種紅花大金元、K326、巖煙97、G80、云煙85和翠碧1號種子置于70%的乙醇溶液中浸泡30 s后，用滅菌去離子水漂洗2次，每次5 min；隨后浸泡于有效氯含量為5%的NaClO水溶液中，輕柔振蕩3 min。最后用滅菌去離子水振蕩漂洗3次，時(shí)間分別為5、15和40 min。將吸干表面水分后的種子轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25 ℃，16 h光照培養(yǎng)/8 h黑暗培養(yǎng)，光照度2600 lx。3～4周繼代擴(kuò)繁1次。

表1　供試青枯菌株材料Table1　The R. solanacearum strains used in this study

1.3室內(nèi)煙草品種組培苗抗性鑒定方法的確立

1.3.1最佳接種濃度的確定 以青枯病抗性水平差異顯著的煙草品種巖煙97和紅花大金元組培苗作為確定最佳接種濃度的試驗(yàn)材料。分別挑選在1/2 MS培養(yǎng)基上生長至4～6葉齡期，植株大小相近巖煙97和紅花大金元無菌苗各10株，超凈工作臺內(nèi)去除干凈根系周圍附著的MS培養(yǎng)基。按1.1方法制備濃度分別為3×107cfu/mL、3×106cfu/mL和3×105cfu/mL的Tb2K9-11菌體懸浮液。參照Tripathi等的方法[5]，將組培苗植株根部分別于不同濃度的菌懸液中浸泡30 min后，滅菌濾紙吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培養(yǎng)基內(nèi)。滅菌水浸根作為對照。30 ℃，16 h光周期條件培養(yǎng)，隔天觀察記載發(fā)病條件。

1.3.2病情嚴(yán)重度統(tǒng)計(jì)和病指計(jì)算方法[8]： 病情嚴(yán)重度分為5級，標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，無癥狀；1級，1個葉片萎蔫；2級，2～3個葉片萎蔫；3級，4片葉片萎蔫；4級，整株死亡。病情指數(shù)按下式計(jì)算：

1.3.3參試煙草品種抗性評價(jià) 選擇了青枯病抗性水平存在差異的煙草品種紅花大金元、翠碧1號、云煙85、K326、G80和巖煙97，于半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至4～6葉齡期，選取大小相近的植株。按照上述方法，采用濃度為3×106cfu/mL的Tb2K9-11菌株的細(xì)菌懸浮液進(jìn)行浸根接種，每品種10株，重復(fù)3次。

1.4萎蔫組培煙苗的分子檢測

由于浸菌接種操作過程中，存在非靶標(biāo)微生物污染的可能。為了確證青枯菌接種體是引起煙草無菌苗產(chǎn)生萎蔫癥狀的始動因子，采用青枯菌種特異性PCR直接對病株組織懸浮進(jìn)行分子檢測，具體方法如下。

無菌條件下將病株主莖切成長5 mm左右的小段，于10 mL 滅菌水中靜置懸浮 15～20 min。直接以1 μL懸浮液作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行檢測；同時(shí)以接種環(huán)挑取懸浮液于TZC平板上劃線，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察分離結(jié)果。

PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，其中含Taq 酶2 U，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，種特異性檢測引物759/760各4 pmoles。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s 和72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min[9]。5 μL PCR 產(chǎn)物于2.5% 的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓5 V/cm，通過Biorad凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2　結(jié) 果

2.1青枯接種體材料的選擇與制備

30 ℃條件下，各參試青枯菌株于TZC培養(yǎng)平板上活化48 ～72 h后，典型的野生型單菌落（強(qiáng)致病力）表現(xiàn)為中央呈粉紅色，外緣白色的奶油狀，形狀不規(guī)則，具流動性（圖1A）?；罨囵B(yǎng)后形成野生型單菌落的青枯菌株材料進(jìn)一步進(jìn)行致病力生物測定，反之則否。

在福建各煙區(qū)的主栽品種中紅花大金元對青枯病最為敏感，且其對致病力強(qiáng)弱不同的3種青枯菌致病型的抗性表現(xiàn)均為高感，因此本研究以紅花大金元作為各菌株致病力篩選的生物測定材料。根據(jù)生物測定接種結(jié)果，選定接種后最先導(dǎo)致煙苗整株萎蔫的強(qiáng)致病力青枯菌株Tb2K9-11作為室內(nèi)抗性快速評價(jià)的接種體材料（圖1B）。

2.2組培扦插苗最佳接種濃度

采用濃度為3×105cfu/mL菌懸液接種，僅出現(xiàn)零星發(fā)病，因此該濃度不適宜作為抗性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)；采用濃度為3×107cfu/mL的菌懸液接種5 d后，開始發(fā)病，接種后13 d，紅花大金元和巖煙97接種植株全部死亡（圖2），兩者抗病性水平無明顯差異，從而表明該接種濃度過大，不適宜作為抗性評價(jià)篩選接種強(qiáng)度。采用濃度為3×106cfu/mL的菌懸液接種7 d后，開始零星發(fā)病，接種后19 d后，紅花大金元植株全部死亡，巖煙97病情指數(shù)依然保持在40左右，兩者抗病性水平存在明顯差異（圖2B），與此前文獻(xiàn)報(bào)道具一定程度相關(guān)性，從而表明該接種濃度適宜作為抗性評價(jià)篩選的挑戰(zhàn)接種強(qiáng)度，后續(xù)的抗性評價(jià)試驗(yàn)中采用了該濃度。

2.3萎蔫植株的快速分子鑒定

經(jīng)青枯菌種特異性PCR檢測，接種后各品種萎蔫植株均可擴(kuò)增獲得片段大小為280 bp的PCR產(chǎn)物（圖3），從而表明青枯菌接種為煙苗萎蔫癥狀產(chǎn)生萎蔫的始動因子。

2.4抗性評價(jià)體系的建立

接種21 d后，紅花大金元、翠碧1號、云煙85、K326、G80和巖煙97的病情指數(shù)分別為100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8（表3），品種間的青枯病抗性水平差異顯著（p<0.05）；參試各品種無菌苗抗性鑒定結(jié)果進(jìn)一步與已有文獻(xiàn)報(bào)道的自然病圃鑒定[10-14]結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)為0.936（p<0.05），呈顯著正相關(guān)，驗(yàn)證了本方法的可靠性，并表明本方法能夠在室內(nèi)接種條件下對不同品種的青枯病抗性水平進(jìn)行快速初步評價(jià)。

圖1　供試接種體篩選結(jié)果Fig. 1　The result of screening of highly virulent R. solanacearum strain

圖2　不同接種濃度接種抗感品種發(fā)病趨勢圖Fig. 2　Pathogenicity test of R. solanacearum strain Tb2K9-11 at different inoculation concentration

圖3　部分萎蔫植株的分子鑒定結(jié)果Fig. 3　Partial results of molecular diagnostics of wilt in vitro plantlets

表3　參試煙草品種抗性鑒定結(jié)果Table3　Results of resistance evaluation of tobacco cultivars

3　討 論

網(wǎng)室接種、人工病圃和大田自然病圃等傳統(tǒng)方法鑒定環(huán)節(jié)繁復(fù)，通常周年或整個生育期僅可完成一次鑒定，于以下方面存在亟待改進(jìn)之處。①經(jīng)濟(jì)可行性：大批量評價(jià)種質(zhì)資源材料抗性時(shí)，需耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力資源；②結(jié)果穩(wěn)定性與可靠性：易受氣候、土壤以及病圃青枯菌系構(gòu)成和初始接種體密度（自然病圃）等因素影響；③資源材料保存：無法繼代重復(fù)利用，低抗材料發(fā)病過重，不利于資源保存；④生態(tài)安全：人工病圃如設(shè)置管理不當(dāng)，可造成病害爆發(fā)流行，存在潛在的生態(tài)安全隱患。

其他基于溫（網(wǎng)）室水培技術(shù)發(fā)展起來的茄子、辣椒和煙草等作物的抗性鑒定法[15-19]，雖在技術(shù)上具一定的創(chuàng)新性與可行性，但仍未完全突破易受環(huán)境干擾，發(fā)病緩慢與程度不足或反之，種質(zhì)資源材料浪費(fèi)、無法繼代等制約瓶頸，因此在時(shí)間、空間、種質(zhì)保存以及成本上仍無法實(shí)現(xiàn)高效、快捷、可持續(xù)以及經(jīng)濟(jì)可行性。

室內(nèi)鑒定可為田間鑒定提供有力參考，其優(yōu)越性在于：不受外界因素干擾，可工廠化作業(yè)和管理；可對育種研究初期獲得的雜交后代，或無性系的試管苗等進(jìn)行早期大量鑒定和篩選；也可對育成的優(yōu)良材料在標(biāo)準(zhǔn)化條件下采用多個菌系（小種或致病型）和不同菌量接種，進(jìn)行抗病性鑒定和評價(jià)[20]。杜喜梅等[21]以煙草無菌試管苗為材料研究了植物對鹽逆境的生理響應(yīng)。孫麗萍等[22]采用毒素培養(yǎng)基法建立了快速、高效、且與田間鑒定結(jié)果高度相關(guān)的煙草種質(zhì)的赤星病抗性評價(jià)方法。與大多數(shù)真菌和丁香假單胞菌引起的病害不同，青枯菌不產(chǎn)生毒素參與其致病過程。故而本研究以無菌試管苗為材料，直接以青枯菌細(xì)胞懸浮液為接種體，并證實(shí)了采用適當(dāng)?shù)慕臃N濃度獲得的室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果吻合度極高，能正確反映出不同煙草品種對青枯病的抗性水平。因此，該方法可以作為評價(jià)煙草品種抗性水平的快速、可靠的高通量初篩手段，并可替代耗時(shí)、耗費(fèi)、耗力的田間鑒定過程。

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《中國煙草學(xué)報(bào)》2016年第4期目次

1 基于氣溶膠粒徑分布測定電子煙煙霧量……………………………………………………………張 霞，韓 熠，李壽波，等

8 能量色散 X射線熒光光譜法快速測定煙草中的鎘和鉛…………………………….……………倪子月，陳吉文，劉明博，等

14 沾色法測定煙用接裝紙耐唾液色牢度………………………………………………...……………葉長文，李 棟，賀 琛，等

23 HXD工序?qū)α弦菏┘有Ч挠绊憽?………………………劉獻(xiàn)軍，秦艷華，張 華，等

30 不同類型流式細(xì)胞儀檢測卷煙煙氣體外微核比對研究…………………..………………..……高 茜，繆明明，李雪梅，等

38 白肋煙煙葉含水率與高溫貯藏過程中 TSNA形成的關(guān)系…………………….…………………孫榅淑，王 俊，許東亞，等

44 曬紅煙重要致香物質(zhì)與使用用途關(guān)系研究…………………………………………………….…劉善民，張 揚(yáng)，王以慧，等

52 氮素形態(tài)對煙苗根系生長及氮素利用的影響……………………………………………………………………邢 瑤，馬興華

62 古巴 Pinar del Rio省優(yōu)質(zhì)雪茄煙種植區(qū)主要生態(tài)因子特征研究………………………………陶 健，劉好寶，辛玉華，等

70 Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia 雜種回交后代中篩選抗黑脛病異源染色體植株初報(bào)…..黨江波，梁國魯，郭啟高，等

75 重慶煙區(qū)青枯雷爾氏菌生化變種及序列變種的特性研究……………………………….………劉 穎，唐元滿，張淑婷，等

83 兩個煙草 Nup96基因的分子克隆及其表達(dá)分析…………………………………………………林世鋒，王仁剛，史躍偉，等

89 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組 SSR標(biāo)記的煙屬植物遺傳多樣性分析………………曾建敏，陳學(xué)軍，吳興富，等

98 黃腐酸鉀對滲透脅迫下烤煙幼苗生長和光合熒光特性的影響…………………………………趙永長，宋文靜，邱春麗，等

107 江西煙區(qū)煙草黑脛病菌生理小種研究初報(bào)… ……………………………………………..……張超群，周澤科，陳榮華，等

111 純電動汽車在卷煙配送中的應(yīng)用探討……………………………………………………………………………孟 博，龐 磊

117 地市煙草信息安全防護(hù)模型的構(gòu)建與應(yīng)用… ………………………………..………………………賴如勤，郭翔飛，于 閩

124 煙草中煙堿轉(zhuǎn)化的遺傳機(jī)理研究現(xiàn)狀及展望… ………………………………………………………蔡長春，程 玲，馮 吉

Study on Granville Wilt Resistance Screening in Tobacco Using an in Vitro Plantlet Inoculation Method

XU Jin1, XU Jingsheng1, ZHANG Hao1, FENG Jie1, GU Gang2*
（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Tobacco Agricultural Research Institute of Fujian, Fuzhou 350003, China）

Granville wilt caused by Ralstonia solanacearum is a major limiting factor in tobacco production in China. The most economically feasible strategy to control the disease is the use of resistant cultivars. In this study, the potential of inoculation of in vitro plantlet as a rapid and reliable method for screening tobacco cultivar against R. solanacearum was investigated. In vitro plantlets of six tobacco cultivars with diverse resistance levels were inoculated with 3×106cfu/mL cell suspension of R. solanacearum strain Tb2K9-11. Twenty-one days after inoculation, the disease index of cultivar Honghuadajiyuan, Cuibi No.1, Yunyan 85, K326, G80 and Yanyan 97 was 100.0, 90.5, 88.8, 86.6, 56.0 and 53.8, respectively. There were significant correlations between in vitro plantlet assay and field trial (r=0.936). The result showed that the in vitro screening assay can help in improving tobacco breeding efficiency.

tobacco cultivar; granville wilt resistance; in vitro plantlet

S435.72

1007-5119（2016）05-0051-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.010

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“作物細(xì)菌性病害防控技術(shù)研究與示范”（201303015）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“青枯菌Po82菌株特異性III型效應(yīng)子鑒定及其功能研究”（31272008）；福建省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草品種對青枯病抗性快速評價(jià)體系建立的研究”{2010[035]}

徐 進(jìn)（1970-），副研究員，從事植物細(xì)菌病害研究。E-mail：jinxuz@ippcaas.cn 。*通信作者，E-mail：gugang318@163.com

2015-11-03

2016-02-23