李小宇，張春雨，郭東全，張淋淋，尤 晴，董英山，王永志,，李啟云,（.吉林省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，東北作物有害生物綜合治理重點實驗室，吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，吉林 公主嶺 600；.東北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，黑龍江 哈爾濱 5000；.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林 長春 08）

雙抗夾心ELISA檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

李小宇1，張春雨1，郭東全1，張淋淋2，尤 晴3，董英山1，王永志1,*，李啟云1,*
（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，東北作物有害生物綜合治理重點實驗室，吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，吉林 公主嶺 136100；2.東北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林 長春 130118）

為快捷有效地檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆，利用已制備的抗除草劑Bar基因編碼蛋白，膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT）單克隆抗體和多克隆抗體，建立PAT蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，對轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆不同組織材料進行定量檢測。結(jié)果顯示，最佳檢測條件為捕獲抗體質(zhì)量濃度0.125 μg/mL，包被酶標板，37 ℃孵育1 h后4 ℃靜置過夜，檢測樣品37 ℃孵育1.5 h，檢測抗體質(zhì)量濃度6.25 μg/mL，37 ℃孵育1.5 h；PAT蛋白的最低檢測限為0.04 ng/mL，大豆蛋白體系中為8 ng/mL；重復性變異系數(shù)小于3%。利用上述檢測條件，對實驗建立的轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆進行PAT蛋白定量檢測，成功地在根、莖、花、葉、種子不同部位檢測到該蛋白的表達。

Bar；雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附；大豆；檢測

草丁膦是一種低毒除草劑，其有效成分為膦絲菌素（phosphinothricin，PPT），Bar基因為抗除草劑基因，編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT）蛋白能夠使除草劑的有效成分PPT自由基乙?；瑥亩χ参锏亩拘訹1-2]。目前，已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)Bar基因的農(nóng)作物，并開始大面積應(yīng)用[3-6]。我國對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測普遍采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和Southern印記雜交等實驗室核酸檢測方法[7-13]，雖然PCR檢測靈敏性高，但PCR檢測重復性差，而Southern雜交耗時長、成本高、難以在基層推廣。以檢測外源蛋白為目的的試紙條法[14]，適合初篩檢驗，但靈敏度相對較低。而基于免疫學的雙抗夾心ELISA檢測法具有耗時短、操作簡單、重復性好、靈敏度高、可實現(xiàn)樣品的高通量等特點。

本研究以已制備的PAT蛋白單克隆抗體和多克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了一套適用于轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法。通過對捕獲抗體工作條件、樣品孵育條件和檢測抗體工作條件的優(yōu)化，提高了該檢測方法的靈敏性和準確性，并適合于基層的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室已制備保存PAT蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體[15]；酶標抗體 美國Sigma公司；轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雙抗夾心ELISA方法的建立

捕獲抗體包被96 孔酶標板，設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照，3 次重復，磷酸緩沖液（phosphate buffer solution with Tween-20，PBST）振蕩清洗3 遍；5%脫脂奶封閉液37 ℃封閉1 h，PBST振蕩清洗3 遍；檢測樣品37 ℃孵育，PBST振蕩清洗3 遍；檢測抗體37 ℃孵育，PBST振蕩清洗3 遍；酶標抗體37 ℃孵育1 h，PBST振蕩清洗6 遍，拍干；室溫避光條件下鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）顯色，2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標儀測定OD490nm值。根據(jù)公式OD490nm樣品（P值）/OD490nm陰性（N值）＞2.1為陽性判定檢測結(jié)果。

1.3.2 雙抗夾心ELISA方法的優(yōu)化

對實驗室保存的4 株P(guān)AT蛋白單克隆抗體，運用雙抗夾心ELISA基本程序進行檢測，3 次重復，選擇P/N最大值對應(yīng)的PAT蛋白單克隆抗體或組合為捕獲抗體。檢測抗體為實驗室已制備保存的PAT蛋白兔源多克隆抗體，根據(jù)方陣滴度法確定捕獲抗體和檢測抗體最佳工作質(zhì)量濃度[16-17]。優(yōu)化捕獲抗體包被時間、檢測樣品孵育時間和檢測抗體孵育時間，確定最佳工作條件。

1.3.3 雙抗夾心ELISA標準曲線的建立及靈敏度

按優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法，取連續(xù)稀釋度的PAT蛋白標準品溶液，每個不同質(zhì)量濃度孔均取3 個平行。對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出滿足該方法的線性方程和標準曲線。根據(jù)實驗結(jié)果計算出雙抗夾心ELISA檢測PAT蛋白的最低檢測限。

提取非轉(zhuǎn)基因大豆籽粒蛋白，將PAT蛋白梯度稀釋，分別與大豆蛋白混合，按優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法檢測PAT蛋白，檢驗該方法在大豆籽粒蛋白環(huán)境下的靈敏度。

為驗證所提模型的實用性，選取某市物流企業(yè)擬選ELV充電站址作為研究對象，對備選方案的實際指標數(shù)據(jù)進行綜合評價?；A(chǔ)數(shù)據(jù)如表2所示。

1.3.4 重復性實驗

板內(nèi)重復性實驗：優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法分別檢測8 份轉(zhuǎn)Bar基因大豆陽性葉片和種子，每份檢測材料3 孔平行，根據(jù)每份檢測材料P/N值計算出板內(nèi)標準差和變異系數(shù)。

換板重復該實驗：根據(jù)測得的P/N值計算出板間每份檢測材料的板間標準差和變異系數(shù)。

1.3.5 檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

采集轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆不同組織，3 個重復，每個重復的小區(qū)內(nèi)采集不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子，每個部分取0.1～0.2 g，液氮研磨，PBS緩沖液1∶10倍稀釋（100 mg‘100 μL），12 000 r/min離心20 min，上清液為待測樣品液，優(yōu)化后，采用雙抗夾心ELISA方法定量檢測PAT蛋白表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAT蛋白雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

根據(jù)OD490nm測定結(jié)果，以P/N最大值確定各個工作參數(shù)。如表1所示，單克隆抗體10C8 P/N值最大，定為捕獲抗體；采用矩陣滴定法確定捕獲抗體和檢測抗體工作質(zhì)量濃度，表2表明，當捕獲抗體工作質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL，檢測抗體工作質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL時，OD490nm值大于1.0，并且稀釋度高，本底低。對捕獲抗體包被時間、檢測樣品孵育時間和檢測抗體孵育時間進行優(yōu)化，如表2、圖1和圖2所示，捕獲抗體孵育時間37 ℃、1 h后4 ℃靜置過夜，檢測樣品孵育時間1.5 h，檢測抗體孵育時間1.5 h時，P/N值最大。說明采用優(yōu)化后的工作參數(shù)，PAT蛋白雙抗夾心ELISA檢測反應(yīng)最佳。

表1 捕獲抗體的確定（OD490 nm值）Table 1 Determination of optimal working concentration of capture antibody (OD490 nm)

表2 矩陣滴定實驗結(jié)果（OD490 nm值）Table 2 The results of matrix titration experiments (OD490 nm)

圖1 捕獲抗體孵育時間對檢測結(jié)果的影響Fig.1 Effect of capture antibody incubation time on the results of detection

圖2 抗原孵育時間和檢測抗體孵育時間對檢測結(jié)果的影響Fig.2 Effect of antigen incubation time on the results of detection

2.2 標準曲線的確定

圖3 靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity of the detection method

如圖4所示，在大豆蛋白環(huán)境中，PAT蛋白質(zhì)量濃度從8 μg/mL開始做10 倍稀釋梯度，當PAT質(zhì)量濃度為8 ng/mL，P/N值＞2.1，說明在大豆蛋白環(huán)境中，各種蛋白酶的作用下，PAT蛋白的最低檢測限高于PAT蛋白體外最低檢測限。

2.3 重復實驗結(jié)果

對8 份檢測材料進行板內(nèi)和板間重復性實驗檢測，表3表明，板內(nèi)變異系數(shù)為0.5%～2.2%，板間變異系數(shù)為0.3%～2.0%，變異系數(shù)均小于3%，表明建立的雙抗夾心ELISA檢測方法的重復性良好。

表3 板內(nèi)和板間重復實驗結(jié)果Table 3 Results of repetitive experiments

2.4 檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

表4 不同組織中PAT蛋白表達量Fig.4 The expression levels of PAT protein in different tissues μg/g

對轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆材料進行檢測，表4表明，PAT蛋白在大豆全株都有表達，可以很好地控制除草劑的危害。不同生長期PAT蛋白表達量有較大的差異，除7111號植株外，其他檢測植株花葉含量最高，根、莖、葉及種子中的PAT蛋白含量均極顯著低于花葉，且各個組織中PAT蛋白表達量差異也極顯著（P＜0.01）。

3 討 論

ELISA檢測技術(shù)是一種快速、簡便的檢測方法，其反應(yīng)條件是影響檢測結(jié)果的重要因素。對微孔封閉是雙抗夾心ELISA檢測法中非常重要的一步，它可以減少抗原蛋白非特異性吸附，從而使檢測結(jié)果更加精確。在檢測中，由于材料中目的蛋白量較少，為了增加檢出幾率，可以選擇不進行封閉[18-19]，雖然可以增加抗原結(jié)合量，但也會使檢測抗體發(fā)生非特性吸附，從而產(chǎn)生假陽性。本研究采用了5%脫脂奶封閉液對微孔進行了徹底的封閉，從而增加了檢測法的準確性。

ELISA實驗中酶標抗體標記酶的選擇至關(guān)重要，使用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為中間催化酶的酶免疫實驗測定放大系統(tǒng)的建立，很大程度上提高了酶免疫實驗的檢測敏感性[20]。另外，常用的作用底物OPD在靈敏度方面優(yōu)于5-氨基水楊酸和鄰聯(lián)苯甲胺。所以，本實驗中使用了OPD作為HRP的底物。

國內(nèi)有研究以多克隆抗體作為捕獲抗體，單克隆抗體作為檢測抗體[21-23]，由于單克隆抗體識別的抗原表位有可能與多克隆抗體識別的抗原表位重疊，形成競爭關(guān)系，這樣影響檢測抗體與檢測樣品的結(jié)合，降低檢測靈敏度；多克隆抗體對抗原表位的親和力不同，容易造成后期洗滌中結(jié)合物的脫落；而以單抗作為捕獲抗體，多抗作為檢測抗體，可以在保證檢測方法特異性的前提下，最大程度提高檢測靈敏度。另外，本研究建立雙抗夾心ELISA方法與間接ELISA方法[24]比較，具有富集作用，特異性更強，能夠高效、準確地檢測待測樣品。

我國是大豆的原產(chǎn)地，也是最大的進口國，由于國內(nèi)大豆需求量逐漸升高，我國每年都需要從美國、巴西和阿根廷等地進口大量轉(zhuǎn)基因大豆[25]，同時我國研究學者也在積極推進轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的研究與推廣。本研究建立PAT蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，可以快速有效地定量檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆，為轉(zhuǎn)基因大豆及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測提供參考。

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Double-Antibody Sandwich ELISA for the Detection of Transgenic Bar Gene Herbicide-Tolerant Soybeans

LI Xiaoyu1, ZHANG Chunyu1, GUO Dongquan1, ZHANG Linlin2, YOU Qing3, DONG Yingshan1, WANG Yongzhi1,*, LI Qiyun1,*
(1. Jilin Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northeast, Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, China; 2. College of Plant Protection, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3. College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

To rapidly and efficiently detect transgenic Bar herbicide-tolerant soybeans, we produced a monoclonal antibody and a polyclonal antibody against phosphinothricin acetyltransferase (PAT) protein encoded by the Bar gene and then utilized them to established a double-antibody sandwich ELISA system for the detection of PAT protein, which could quantify PAT in different tissues and materials from transgenic Bar herbicide-tolerant soybeans. Reaction conditions were optimized as follows: 0.125 μg/mL capture antibody was coated onto the microtiter plates at 4 ℃ overnight after incubation at 37 ℃ for 1 h, the antigen was incubated at 37 ℃ for 1.5 h, and the detection antibody at 6.25 μg/mL was incubated at 37 ℃ for 1.5 h. The detection sensitivity was 0.04 ng/mL for purified PAT and 8 ng/mL for crude soybean protein. The coefficient of variation of reproducibility was less than 3%. This method has been successfully applied to detect the expression of PAT in the root, stem, leaf, flower and seed of transgenic soybean.

Bar; double-antibody sandwich ELISA; soybeans; detection

10.7506/spkx1002-6630-201604040

Q788

A

1002-6630（2016）04-0222-04

李小宇, 張春雨, 郭東全, 等. 雙抗夾心ELISA檢測轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 222-225.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604040. http://www.spkx.net.cn

LI Xiaoyu, ZHANG Chunyu, GUO Dongquan, et al. Double-antibody sandwich ELISA for the detection of transgenic Bar gene herbicide-tolerant soybeans[J]. Food Science, 2016, 37(4): 222-225. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604040. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

吉林省自然科學基金項目（20130101089JC）；吉林省中青年科技領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團隊項目（20121812）；

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08004）

李小宇（1981—），男，助理研究員，碩士，研究方向為植物病毒與生物反應(yīng)器。E-mail：lxyzsx@163.com

*通信作者：王永志（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為植物病毒與生物反應(yīng)器。E-mail：yzwang@126.com

李啟云（1974—），男，研究員，博士，研究方向為植物保護。E-mail：qyli1225@126.com