陳美君，王 旻，亢美娟，段奇慧，尚教文，單 藝,（.東北農業(yè)大學 黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 5008；.黑龍江民族職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 50066）

超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素

陳美君1，王 旻1，亢美娟1，段奇慧2，尚教文2，單 藝1,*
（1.東北農業(yè)大學 黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 150028；2.黑龍江民族職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 150066）

目的：建立一種能夠同時測定嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素的超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法。方法：樣品用0.1%甲酸溶液溶解，乙酸鋅沉淀蛋白，濾液經ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離，流動相為0.1%甲酸溶液和乙腈，梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式，多反應監(jiān)測進行檢測，分析時間12 min。結果：11 種B族維生素在各自質量濃度范圍內線性良好，R2均大于0.99，加標回收率在85%～110%之間，相對標準偏差在1.03%～6.75%之間，VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、泛酸（VB5）、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、葉酸、游離生物素和VB12的定量下限分別為40.0、40.0、30.0、30.0、50.0、0.9、1.2、1.2、2.0、2.0、0.2 ?g/100 g，與國家標準比較，部分維生素定量限提高了7.7%～60%。結論：該法具有靈敏度高、前處理操作簡單快速、分析時間短的特點，而且具有良好的精密度和準確性，可以應用于嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素的同時測定。

B族維生素；嬰幼兒配方乳粉；超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法

維生素是維持人體正常機能不可缺少的營養(yǎng)物質，人體必需維生素可分為兩類：水溶性維生素和脂溶性維生素，其中水溶性維生素中又以B族維生素最為重要[1-2]，B族維生素主要包括VB1（鹽酸硫胺素）、VB2（核黃素）、VB3（煙酰胺、煙酸）、VB5（泛酸）、VB6（吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）、VB7（游離生物素）、VB9（葉酸）、VB12（氰鈷維生素）等，它們雖然在體內的含量很少，卻是調節(jié)人體各種新陳代謝必不可少的物質，在人體生長、發(fā)育及維持身體健康的過程中卻發(fā)揮著重要的作用，當人體缺乏時會引起多種疾病，而維生素無法人體合成必須由食物供給，因而成為嬰兒配方乳粉的重要組成部分[3-4]。目前B族維生素的檢測方法有很多[5-11]，其中乳制品中葉酸、VB12和生物素的測定我國國家標準采用微生物分析方法[12-14]，VB1、VB2、VB3、VB5、VB6的測定采用高效液相色譜法[15-19]，微生物法靈敏度高但步驟繁鎖、實驗周期長、環(huán)境要求高、影響因素多，且重復性稍差[20-21]，而高效液相色譜法具有樣品前處理簡單的優(yōu)勢，然而因其化學性質和結構差別大，分離測定困難，許多需要使用離子對試劑，易造成性質相近的維生素保留時間和洗脫順序發(fā)生變化，影響測定結果的準確性和重復性，普通檢測器很難同滿足對各種待測物質的檢測要求，因此目前高效液相色譜法可同時測定的水溶性維生素種類偏少[22-26]。隨著分析儀器開發(fā)技術的發(fā)展，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法為食品、醫(yī)藥等領域的分析工作開拓了更為廣闊的前景。研究表明，在測定維生素方面，質譜檢測器有更明顯的優(yōu)勢，可提供可靠、精確的相對分子質量及結構信息，具有靈敏度高、分辨率高、特異性好、重復性好、選擇性好、定量更加準確等特點[27-35]，而超高壓液相色譜除具有高效液相色譜優(yōu)點外，還獨具耐高壓特性，可使用小粒徑填料色譜柱，在液相色譜分析中，小粒徑填料色譜柱可獲得更高的柱效和更快的分離速度，峰容量更大，能夠更好地滿足復雜樣品的分析[36-37]。

本研究采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定嬰幼兒配方乳粉中的11 種B族維生素，探求樣品前處理簡單快速、分析時間短、重復性好、精密度高的測定方法，為嬰幼兒配方乳粉中B族維生素的快速定量檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種嬰幼兒配方乳粉（樣品1～10） 市購；國際質控樣（標準參照物）：1849a（美國）；標準品（純度）分別為VB1（≥99%）、VB2（≥98%）、煙酸（≥99.5%）、煙酰胺（≥98%）、泛酸（≥98%）、吡哆醛（≥99%）、吡哆醇（≥98%）、吡哆胺（≥98%）、葉酸（≥97%）、生物素（≥99%）、VB12（≥98%）及甲酸（色譜純） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；濃鹽酸（優(yōu)級純，37%）、乙酸銨（優(yōu)級純）、磷酸二氫鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司；甲酸銨（優(yōu)級純） 德國Flcka公司；木瓜蛋白酶（酶活≥600 U/g） 上海沃凱生物技術有限公司；水為超純水（經Millipore超純水裝置處理）。

1.2 儀器與設備

UPLC XEVO TQ-MS/MS超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）、ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱 美國Waters公司；BS224S電子天平 德國賽多利斯公司；渦流振蕩器 德國IKA公司；超純水儀 美國Millipore公司；s430/r離心機 德國Eppendorf公司；PH 700 pH計美國Eutech公司；GMSX-280手提式高壓滅菌鍋 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；S10P超生波清洗器 美國致微儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別稱取VB1標準儲備液：稱取0.011 1 g標準品，用0.01 mol/L鹽酸溶解并定容于10 mL容量瓶，質量濃度為0.987 9 mg/mL；VB2標準儲備液：精確稱取0.002 5 g標準品，加入0.1 mol/L鹽酸5 mL，避光超聲溶解后，立即用水轉移并定容至50 mL棕色容量瓶中，質量濃度為50 μg/mL；分別稱取標準品煙酸0.050 7 g、煙酰胺0.056 6 g、泛酸0.050 0 g、吡哆醛0.030 5 g、吡哆醇0.039 9 g、吡哆胺0.030 4 g，用水溶解并定容至50 mL容量瓶中，質量濃度為分別為1.014 0、1.132 0、0.920 0、0.500 8、0.656 0、0.423 8 mg/mL；葉酸標準貯備液（1 mg/mL）：稱取0.05 g葉酸標準品，用30 mL蒸餾水溶解轉入50 mL容量瓶中，加1 mL氨水，用水定容。生物素標準貯備液（100 μg/mL）：稱取生物素標準品用乙醇溶液定容至生物素質量濃度為100 μg/mL；VB12貯備液（10 μg/mL）：精確稱取VB12標準品，用乙醇溶液定容至VB12質量濃度為10 μg/mL。以上標準儲備液配制完成后放入棕色試劑瓶中2～4 ℃冰箱冷藏，保存期為3 個月，配制校準曲線時用超純水逐級稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 超高壓液相色譜參考條件

色譜柱：A C Q U I T Y U P L C H S S T 3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，進樣體積10 μL，流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈，采用梯度洗脫，如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3 質譜參數(shù)條件

電噴霧離子源正離子模式，多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/min；離子源溫度：150 ℃；其他質譜參數(shù)見表2。

表2 質譜MRM參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters

1.3.4 樣品的前處理

稱取5.00 g樣品（精確至0.01 g）于100 mL三角瓶，用25.0 mL 0.1%甲酸溶液溶解，超聲提取20 min后加入2 mL 20%乙酸鋅溶液混勻，冷卻至室溫后轉移至50 mL容量瓶中用水定容，混勻，濾紙過濾，取濾液過0.22 μm水膜，待上機。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱屬于通用型色譜柱，pH值耐受范圍為1～12，穩(wěn)定性好，適用于廣泛化合物的分析測定。ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱用于水溶性的、極性大的小分子化合物，HSS T3柱固定相是與100%水溶液流動相兼容的C18固定相，用于保留和分離極性有機物。本實驗分別考察了UPLC BEH C18和UPLC HSS T3兩種色譜柱對11 種待測化合物的分離情況。實驗用同一混合標準物質溶液對備選的兩種型號色譜柱分別進樣，經比較，ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱同時分離11 種被測組分時，各個組分得到很好地分離，峰形尖銳對稱，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離各組分效果不佳，其中葉酸出現(xiàn)裂峰，VB2在8.11 min出峰，峰響應值底于雜質峰，VB1、吡哆醛出現(xiàn)雙峰，吡哆醇峰形呈寬峰、雙峰的異常峰，吡哆胺、煙酸峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，煙酰胺峰形寬，因此表明UPLC HSS T3色譜柱分離效果優(yōu)于UPLC BEH C18色譜柱，如圖1所示。本實驗最終確定選用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）作為分析色譜柱。

圖1 比較BEH C18和HSS T3的色譜圖Fig.1 Comparison of chromatographic separation on BEH C18and HSS T3

2.1.2 流動相的選擇

質譜應用技術中，流動相的選擇除考慮色譜的分離效果外還要考慮化合物的離子化，由于本實驗選用電噴霧離子化，正離子模式模式，所以在流動相中添加乙酸銨、甲酸銨或甲酸有利于被測物的離子化和改善色譜峰，因此分別比較了乙腈、甲醇作為有機相，10 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L甲酸銨、0.1%甲酸溶液作為水相交叉組合實驗，進樣同一混合標樣，同時通過調節(jié)流動相比例及流速獲得最佳條件，結果表明0.1%甲酸溶液對被測的11 種化合物的電離均有促進作用且響應值最高，經比較在流速為0.25 mL/min時，選用0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相各組分分離效果良好，峰形對稱豐度響應值最高，無雜質峰干擾。因此本實驗流動相選用0.1%甲酸溶液和乙腈，分析時間12 min，經優(yōu)化確定最終梯度洗脫條件如表1所示。在該條件下一次進樣分離11 種被測組分，11 種物質分別在11 個通道中的MRM掃描總離子圖如圖2所示。

圖2 MRM掃描總離子圖Fig.2 MRM total ion current chromatograms

2.1.3 樣品前處理方法的選擇

本實驗分別選擇水、0.1%甲酸溶液、乙腈和0.1 mol/L鹽酸溶液作為提取液，稱取5 g樣品，分別加入20 mL水、0.1%甲酸溶液、乙腈和0.1 mol/L鹽酸溶液，其中0.1 mol/L鹽酸樣品采用高壓水解法，利用手提式高壓滅菌鍋，121 ℃高壓水解20 min的方式破化乳中的蛋白質和脂肪，釋放可能存在的結合態(tài)被測組分，其余3 種通過超生30 min充分提取被測組分，提取后用水定容至50 mL，濾紙過濾后取濾液過0.22 μm水系過濾頭至進樣瓶中進行測定，通過比較回收率選擇提取率高的試劑作為提取液。結果表明，高壓水解法處理樣品，吡哆醇、吡哆醛損失明顯，煙酸、煙酰胺回收率低，因此不適用于樣品前處理，而用水和乙腈作為提取液的回收率普各組分回收率遍低于0.1%甲酸溶液的回收率，所以最終選用0.1%甲酸溶液作為提取液，但總體回收率偏低，如圖3所示。由于11 種B族維生素均為水溶性維生素，但其化學性質區(qū)別大，且在嬰幼兒配方乳粉中含有大量的蛋白質、脂肪和多種維生素礦物質等，干擾因素繁多，背景高，基質效應突出，回收率低，會直接影響準確的定量，同時還會嚴重縮短色譜柱使用壽命等，因此在保證提取率的同時，要盡可能的凈化樣品[38-40]。本實驗分別利用等電點法（1 mol/L鹽酸溶液調pH 1.5～2.2后再用10%氫氧化鈉溶液調pH 4～5），離心法（5 000 r/min離心10 min）和添加20%乙酸鋅沉淀劑凈化樣品，當采用等電點法和添加沉淀劑法時，均可得到澄清溶液，凈化效果較好，而離心法則不能得到澄清溶液，凈化效果不理想，不滿足實驗要求，其中等電點法雖然樣品凈化效果較好，但由于樣品要經過pH 1.5～2.2的低pH值階段，使得被測組分中對酸不穩(wěn)定的化合物如葉酸、VB12出現(xiàn)損失，造成回收率低定量不準的問題[41]，不能滿足實驗要求。最終實驗發(fā)現(xiàn)，用0.1%甲酸溶液溶解樣品，超聲提取后加沉淀劑乙酸鋅，過濾過膜后上機，經測定11種維生素平均回收率在85%～110%之間，滿足實驗要求，確定了前處理方法。

圖3 回收率實驗結果Fig.3 Effect of extractant type on the recovery of B vitamins

2.2 質譜條件的選擇

選用電噴霧離子源正離子模式下，11 種維生素均能獲得較高豐度的母離子，其中除VB12外均可得到[M＋H]＋峰，而VB12得到的母離子m/z為678.6，由于VB12分子式為C36H88CoN14O14P，相對分子質量1 355.38，其母離子（m/z）678.6為相對分子質量加2H的一半，即VB12在電噴霧離子源正離子下，生成[M＋2H]＋峰。因此采用電噴霧離子源正離子模式，VB12采用雙電荷形式的質荷比作為母離子，其余10 種選用單電荷形式的質荷比作為母離子。確定母離子后，采用子離子掃描，選擇高豐度特征碎片離子作為子離子，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選用產生最高豐度碎片離子的錐孔電壓和碰撞能量為最優(yōu)錐孔電壓和碰撞能量。最終優(yōu)化結果見表2。

2.3 方法學評價

2.3.1 方法的線性范圍和檢出限

表3 方法的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients and limits of detection of the method

用0.1%甲酸溶液，配制標準溶液，繪制標準曲線，11 種維生素均具有良好的線性關系，以信噪比為3時的進樣質量濃度為最低檢出質量濃度，以信噪比為10時的進樣質量濃度為最低定量質量濃度，根據(jù)樣品前處理最終計算得出該方法的檢出限和定量限，VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、葉酸、游離生物素和VB12的定量限分別為40.0、40.0、30.0、30.0、50.0、0.9、1.2、1.2、2.0、2.0、0.2 ?g/100 g，與國家標準比較，部分維生素定量限提高了7.7%～60%，結果如表3、4所示。

表4 優(yōu)化方法和國標方法測定定量限的比較Table 4 Comparison of the limits of quantitation for B vitamins using tthhee ddeevveellooppeedd mmeetthhoodd aanndd tthhee nnaattiioonnaall ssttaannddaarrddss ooff CChhiinnaa

2.3.2 精密度實驗結果

取11 種混合標準溶液3 個質量濃度，每個質量濃度連續(xù)進樣6 次，得到各組分保留時間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.11%～0.22%，色譜峰面積RSD為0.78%～1.31%，表明儀器精密度良好，具體結果見表5。

表5 不同質量濃度精密度實驗結果（n=6）TTaabbllee 55 RReessuullttss ooff pprreecciissiioonn tteessttss aatt vvaarriioouuss ccoonncceennttrraattiioonnss ((n == 66))

續(xù)表5

續(xù)表6

2.3.3 回收率和重復性實驗結果

表6 加標回收實驗和RSD結果（n=6）TTaabbllee 66 RReessuullttss ooff ssppiikkeedd rreeccoovveerryy aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonn (RSDDss)) ((n == 66))

10號樣品中分別添加3 個不同質量濃度的標準溶液進行測定，如表6所示，每個水平設定6 組平行實驗，結果顯示待測11 種維生素平均回收率在85%～110%之間，RSD在1.03%～6.75%之間。結果表明該方法在不同添加水平均有很好的回收率和重復性，方法的準確度與精密度滿足實驗需求。

2.4 實際樣品檢測結果

分別用所建立的超高壓液相色譜-質譜法和國標法：GB 5413.11—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B1的測定》[15]、GB 5413.12—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定》[16]、GB 5413.15—2010《嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定》[18]；GB 5413.17—2010《嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》[19]；GB 5413.13—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B6的測定》[17]；GB 5413.16—2010《嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定》[12]；GB 5413.19—2010《嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定》[14]；GB 5413.14—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[13]，測定10 種不同嬰幼兒乳粉和國際質控樣中的11 種B族維生素，將國際質控樣說明中給出的中位值視為11 種待測組分含量的真實值，給出的允許范圍作為實驗數(shù)據(jù)允許的檢測結果浮動范圍，通過國標法同時測定，得到的實際測定質控樣數(shù)據(jù)與質控樣給出的中位值比較，均在允許范圍內，說明國標法測得的10 種不同嬰幼兒乳粉的數(shù)據(jù)準確可靠，然后應用本實驗建立的超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定國際質控樣和10 種不同嬰幼兒配方乳粉，數(shù)據(jù)表明國際質控樣的測定值均在允許范圍內且和國標法測定結果吻合，相對誤差在2.1%～10.0%之間，因此該方法適用于嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素的同時測定，結果準確可靠，如表7所示。

表7 樣品含量的測定Table 7 Contents of 11 B vitamins in real samples determined by UPLC-MS/MS ?g/100 g

3 結 論

本實驗建立了同時進行測定嬰幼兒配方乳粉中的VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、葉酸、游離生物素和VB12的超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法，樣品經0.1%甲酸溶液提取，乙酸鋅沉淀蛋白，應用超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜進行檢測，通過MRM掃描方式12 min完成11 種B族維生素的測定，該方法操作簡單、分析時間短、重復性好，經方法學驗證，所建立方法具有良好的準確度、精密度與重復性，結果準確靈敏度高，通過測定10 種未知樣品和國際質控樣，測定結果與國標法測定數(shù)據(jù)比較，結果吻合且國際質控樣的測定結果均在允許范圍內，因此本法可用于嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素的同時測定。

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Simultaneous Determination of 11 B Vitamins in Infant Formula by UPLC-MS/MS

CHEN Meijun1, WANG Min1, KANG Meijuan1, DUAN Qihui2, SHANG Jiaowen2, SHAN Yi1,*
(1. Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center, Northeast Agricultural University, Harbin 150028, China; 2. Heilongjiang National Vocational College, Harbin 150066, China)

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of 11 B vitamins in infant formula by ultrapressure liquidchromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Methods: The samples were dissolved in 0.1% formic acid and then added with xinc acetate to precipitate the proteins. Then the filtrate was separated by an ACQUITY UPLC HSS T3 column through gradient elution using 0.1% formic acid and acetonitrile as the mobile phase. Mass spectral acquisition was done in the positive ion mode by applying multiple reaction monitoring and the analysis was completed in 12 min. Results: High correlation coefficients (R2> 0.99) for 11 B vitamins in their linear ranges were obtained. The spiked recovery rates and accuracy (expressed as relative standard deviation, RSD) were determined to be in the ranges of 85%–110% and 1.03%–6.75%, respectively. The limits of quantitation (LOQs) for vitamin B1, vitamin B2, nicotinic acid, niacinamide, pantothenic acid, pyridoxal, pyridoxine, pyridoxamine, folic acid, vitamin H and vitamin B12were 40.0, 40.0, 30.0, 30.0, 50.0, 0.9, 1.2, 1.2, 2.0, 2.0, and 0.2 ?g/100 g, respectively, an increase by 7.7% to 60% over those from the national standards of China. Conclusions: The method is characterized by high sensitivity, simple operation, fast analysis and short time. This method also has good precision and accuracy and can be applied to detect 11 B vitamins in infant formula.

B vitamins; infant formula milk powder; ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

10.7506/spkx1002-6630-201604026

TS252.7

A

1002-6630（2016）04-0144-10

陳美君, 王旻, 亢美娟, 等. 超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定嬰幼兒配方乳粉中11 種B族維生素[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 144-153. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604026. http://www.spkx.net.cn

CHEN Meijun, WANG Min, KANG Meijuan, et al. Simultaneous determination of 11 B vitamins in infant formula by UPLC-MS/MS[J]. Food Science, 2016, 37(4): 144-153. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604026. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

陳美君（1990—），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。E-mail：chenmeijun0872@163.com

*通信作者：單藝（1981—），女，高級工程師，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：Shanyi_1@sian.com