周 丹，文連奎，董周永，周亞軍,（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 308；.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 300）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉工藝

周 丹1，文連奎1，董周永2，周亞軍2,*
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022）

為解決河蚌肉的肉質(zhì)粗韌問題，提高其食用品質(zhì)，利用 超聲波輔助木瓜蛋白酶對其嫩化處理。通過Box-Behnken試驗設(shè)計，建立了綜合評分與超聲功率、超聲時間、木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的二次回歸模型；確定超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉的最佳工藝參數(shù)為木瓜蛋 白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min，此時河蚌肉嫩化效果最佳。與木瓜蛋白酶、超聲波、CaCl2嫩化效果相比，可溶性蛋白含量提高48%，硬度和咀嚼性分別降低63%和65%。

河蚌肉；嫩化；超聲波；木瓜蛋白酶

河蚌是一種普通的淡水雙殼類動物，是中國特有資源。在我國河蚌業(yè)中，河蚌主要為了獲得珍珠，產(chǎn)珠后大多數(shù)河蚌肉被丟棄，帶來資源浪費和環(huán)境污染。河蚌肉營養(yǎng)豐富，有涼血降脂、滋陰明目等功效[1]，其蛋白含量高、脂肪含量低，是大多消費者普遍追求的健康食品[2]，但河蚌肉因肉質(zhì)粗韌而一直未被充分利用。超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉是利用超聲波的空化效應(yīng)及機械作用[3]使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加酶的接觸量，提高嫩化效果。超聲波輔助酶法主要應(yīng)用于有效成分的提取[4-5]，而在肉嫩化方面的應(yīng)用研究至今鮮有報道。本實驗將超聲波輔助木瓜蛋白酶用于野生河蚌肉嫩化，為蚌肉嫩化提供一種新方法，同時拓寬超聲波的應(yīng)用領(lǐng)域，對提高蚌肉食用品質(zhì)及商業(yè)價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河蚌產(chǎn)于吉林省松原市扶余市長春嶺鎮(zhèn)。

碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 北京化工廠；硫酸銅天津市福晨化學(xué)試劑廠；酒石酸鉀鈉 天津市華東試劑廠；過硫酸銨、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺 西隴化工股份有限公司；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R250 上海惠世生化試劑有限公司；N,N-甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷 上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠；甲醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、1,4-二硫代蘇糖醇、四甲基乙二胺、丙三醇、冰醋酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DB數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；pH S-25型數(shù)字酸度計 杭州東星儀器設(shè)備廠；MZS-小型實驗均質(zhì)機 無錫市永如輕化設(shè)備廠；TGL-16gR型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；JA3003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；DYCA-24DN型雙垂直板電泳儀 北京六一儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CT3-50 kg質(zhì)構(gòu)儀 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

新鮮的河蚌清洗干凈，去除蚌殼、蚌淚及內(nèi)臟，將河蚌肉切成大小薄厚均勻，質(zhì)量9 g的肉塊，并與配制好的100 mL木瓜蛋白酶溶液裝在雙層聚乙烯塑料袋中，在真空度600 Pa條件下真空包裝，進(jìn)行超聲處理。嫩化處理后，所有樣品貯存在4 ℃條件下備用。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 可溶性蛋白含量

可溶性蛋白含量的變化對肉的嫩度有影響[6]。參照李蘭會等[7]的方法，根據(jù)實驗條件進(jìn)行適當(dāng)修改，取河蚌肉9.00 g，剪碎后加入90 mL提取液（20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L CaCl2、100 mmol/L KCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH 7.0），提取液貯存于0～4 ℃。用均質(zhì)機將河蚌肉搗碎均勻，勻漿后倒入10 mL離心管中，在8 500 r/min條件下冷凍離心30 min，用雙縮脲法[8]測定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.2.2 質(zhì)構(gòu)特性

通過質(zhì)構(gòu)儀穿透法[9-10]測定河蚌肉的硬度和咀嚼性。室溫條件下檢測，每組樣品測量8 次，取平均值。

1.3.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

河蚌肉大分子蛋白質(zhì)在超聲波輔助酶法處理條件下，部分降解為小分子蛋白和多肽，分子質(zhì)量變小，用SDS-PAGE可直觀地表示這一現(xiàn)象[11]。濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%。用1.0 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.0）將可溶性蛋白的質(zhì)量濃度調(diào)整至（3.0±0.5）mg/mL，取20 μL樣品，加入5 μL 5倍稀釋的樣品緩沖液，沸水浴5 min。取5 μL處理后的液體點樣，進(jìn)行凝膠電泳[12]。

1.3.2.4 感官特性評價

感官評定小組由7 名碩士研究生組成，對嫩化后河蚌肉的色澤、黏度、彈性進(jìn)行感官評價[1]，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standardss

1.3.2.5 蒸煮損失率

將嫩化處理后的蚌肉樣品分別放入聚乙烯塑料薄膜袋中、封口，于95 ℃水浴鍋中加熱40 min，取出后立即用流動水冷卻至室溫。用濾紙吸干蚌肉樣品表面水分，用分析天平稱量樣品加熱處理前后的質(zhì)量，按下式計算蒸煮損失率。每個處理重復(fù)測量3 次，取平均值作為測量數(shù)據(jù)。

1.3.3 超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化蚌肉工藝優(yōu)化試驗

對木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲功率3 個主要因素，進(jìn)行基于Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面優(yōu)化試驗研究[14]，因素水平編碼見表2。以可溶性蛋白含量、質(zhì)構(gòu)特性、感官評價為指標(biāo)對河蚌肉嫩化效果進(jìn)行綜合評價，采用SPSS 17.0軟件中的因子分析，將評價指標(biāo)結(jié)合得出綜合評分，探索超聲波輔助酶法嫩化蚌肉的最佳工藝參數(shù)。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.1、Design-Expert 8.0.6和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 各單因素對可溶性蛋白含量的影響

圖1 不同因素對可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of tenderization conditions on soluble protein content

木瓜蛋白酶是特異性蛋白水解酶，可將河蚌肉肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、膠原蛋白和結(jié)締組織彈性蛋白降解生成其他小分子蛋白[15-16]。在超聲波作用下，可削弱肌球蛋白和肌動蛋白間相互作用，肌纖維受到破壞。將超聲波與木瓜蛋白酶同時作用于河蚌肉，超聲波處理對肌纖維蛋白產(chǎn)生機械物理破壞作用，同時其空化作用使線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)和溶酶體膜破壞，加快木瓜蛋白酶溶液的擴散和滲透，提高嫩化效果[17-18]。由圖1a可知，隨著超聲功率的增加，可溶性蛋白含量先增大后減小，功率在150 W時，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，比對照組（未作處理）增加30%。由圖1b可知，隨著木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，可溶性蛋白含量逐漸增大，當(dāng)木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時，可溶性蛋白含量逐漸平緩并趨于穩(wěn)定。由圖1c可知，隨著超聲時間的延長，可溶性蛋白含量快速增大，25 min時可溶性蛋白含量達(dá)到最大，之后有緩慢減小的趨勢，結(jié)果與劉新玲等[19]的研究基本一致。由圖1d可知，隨著pH值的升高，可溶性蛋白含量逐漸增加后降低，pH值達(dá)到6.5時，可溶性蛋白含量達(dá)到最大。

2.1.2 各單因素對質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖2 不同因素對質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.2 Effects of tenderization conditions on texture properties of mussel

由圖2a可知，當(dāng)超聲功率在150 W時，硬度最小，咀嚼性趨于平穩(wěn)。結(jié)果與Siró等[20]的研究基本一致。由圖2b可知，隨著木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，硬度和咀嚼性顯著降低，當(dāng)木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時，硬度和咀嚼性分別降低60%、57%，結(jié)果與蘇丹[12]的研究基本一致。由圖2c可知，超聲時間在25 min時，硬度和咀嚼性分別降低63%和66%。由圖2d可知，木瓜蛋白酶pH值對河蚌肉硬度和咀嚼性影響明顯，pH 5.5時硬度達(dá)到最小，pH 7.5時咀嚼性最小。這說明，超聲波與木瓜蛋白酶對提高蚌肉嫩度有協(xié)同作用，可有效降低蚌肉硬度和咀嚼性。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、超聲功率（X2）、超聲時間（X3）為試驗因素，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件中因素分析將硬度、咀嚼性、彈性、感官評價以及可溶性蛋白含量擬合為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken優(yōu)化試驗。試驗設(shè)計因素水平及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

試驗數(shù)據(jù)通過Design-Expert軟件回歸分析，得到超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉綜合評分Y與影響因素關(guān)系的二次多項回歸方程：

如表4所示，該模型F值為45.32，P＜0.000 1，說明回歸方程模型極顯著；失擬項P值為0.152 6，表明該模型相對于絕對誤差不顯著，說明通過試驗得到的二次回歸方程能很好地對響應(yīng)面值進(jìn)行預(yù)測。模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.983 1，表明自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可用于試驗的理論預(yù)測。調(diào)整確定系數(shù)＝0.961 4，表明回歸方程與試驗值具有高度擬合性，說明該模型可很好解釋響應(yīng)值的變化[21]。因此，該回歸模型可用來對超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的工藝優(yōu)化。經(jīng)回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時間的一次項和平方項、超聲功率和超聲時間交互作用均為顯著項。注：**.差異極顯著，P＜0.01；*.差異顯著，P＜0.05。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance of regression model

圖3 各因素交互影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots showing the effects of operating parameters on tenderization efficiency

從圖3可以看出，木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時間3 個因素的兩兩交互作用中，超聲功率和超聲時間的交互作用顯著，并且較高的綜合評分出現(xiàn)在3D效果的中心區(qū)域，綜合評分由中心向邊緣逐漸減小。

通過Design-Expert軟件對各因素求導(dǎo)，得出超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.27%、超聲功率157.91 W、超聲時間27.17 min。在此最佳條件下，綜合評分的理論值為1.102 17。為進(jìn)一步驗證響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性，對最優(yōu)條件進(jìn)行實際調(diào)整，在木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min的條件下進(jìn)行3 次驗證實驗。得到嫩化效果的綜合評分值為0.992 34，與預(yù)測綜合評分值接近。因此，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的超聲波輔助酶法嫩化河蚌肉的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可為河蚌肉的嫩化工藝提供理論依據(jù)。

2.3 不同嫩化方法的對比實驗結(jié)果

表5 不同嫩化方法的對比Table 5 Comparison of different tenderization methods

使用不同的嫩化方法的最佳條件，對河蚌肉嫩化處理。由表5可知，不同嫩化方法均能使河蚌肉可溶性蛋白含量、質(zhì)構(gòu)特性、感官評分和蒸煮損失率發(fā)生改變。超聲波-木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶、CaCl2、超聲波處理后河蚌肉的可溶性蛋白含量分別比對照提高48%、32%、8%、19%。其中超聲波輔助木瓜蛋白酶處理的河蚌肉可溶性蛋白含量最高。超聲波-木瓜蛋白酶處理后樣品的硬度和咀嚼性比對照組降低63%、65%，且低于其他嫩化方法。這表明超聲波-木瓜蛋白酶處理的河蚌肉更易消化。

由表5可知，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理后樣品黃色均勻，外表微干不黏，新切面濕潤，彈性有較大幅度提高。木瓜蛋白酶處理后的樣品彈性提高也很明顯，但樣品變白嚴(yán)重，外表較黏，這可能是由于木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大或作用時間過長，使蚌肉膠原蛋白和肌原纖維蛋白過度降解，從而肉的色澤和形態(tài)變差。超聲波-木瓜蛋白酶處理后的蒸煮損失率減少23%，這可能是由于超聲波處理使肌肉纖維間距和肌節(jié)變寬、細(xì)胞破裂，使水分進(jìn)入到細(xì)胞中，使細(xì)胞的持水性增加，蒸煮損失率減小。

圖4 不同嫩化方法處理后河蚌肉蛋白質(zhì)SDS-PAGGEE圖Fig.4 SDS-PAGE of mussel treated by different tenderization methods

由圖4可知，不同嫩化方法對河蚌肉的蛋白都有降解，與對照組相比，分子質(zhì)量約為220 kD的肌動蛋白和97.2 kD的大分子蛋白消失，介于14.3～29 kD的a條帶和b條帶明顯變寬且顏色加深，且2號泳道變化最明顯，這表明，超聲波-木瓜蛋白酶處理后，河蚌肉中的肌動蛋白和膠原蛋白等大分子蛋白降解生成小分子蛋白或多肽，嫩化效果明顯。

綜上所述，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理改善肌肉組織結(jié)構(gòu)，提高嫩化效率，使肉的硬度和咀嚼性降低、彈性和持水性提高，使蚌肉易消化吸收。同時降低酶添加量，較大程度減輕酶對蚌肉色澤的影響，使蚌肉具有良好的感官特性。因此，超聲波-木瓜蛋白酶優(yōu)于木瓜蛋白酶處理等其他嫩化方法。

3 結(jié) 論

Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化出超聲波-木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉的最佳工藝參數(shù)為木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、超聲功率150 W、超聲時間27 min。不同嫩化方法對比實驗表明，超聲波-木瓜蛋白酶嫩化處理后樣品可溶性蛋白含量提高48%，硬度和咀嚼性分別降低63%和65%，蒸煮損失率減少23%，持水性和彈性提高，樣品色澤和形態(tài)較好。因此，超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化蚌肉效果最佳，耗時最短。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Papain Treatment for Tenderizatoin of Freshwater Mussel

ZHOU Dan1, WEN Liankui1, DONG Zhouyong2, ZHOU Yajun2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China)

In order to improve the taste of freshwater mussel meat, tenderization was carried out by ultrasound-assisted papain treatment. Using Box-Behnken experimental design, a quadratic regression model was developed indicating the effect of ultrasonic power, ultrasonication time, and enzyme concentration on tenderization efficiency. Through response surface analysis of the established model, the optimal parameters that provide the best tenderness of mussel meat were determined as 6%, 150 W and 27 min for enzyme concentration, ultrasonic power and ultrasonication time, respectively. Compared with individual treatment with papain, ultrasound and CaCl2, the combined treatment resulted in a 48% increase in soluble protein content of mussel meat, with a simultaneous decrease in hardness and chewiness by 63% and 65%, respectively.

freshwater mussel; tenderness; ultrasound-assisted treatment; papain

10.7506/spkx1002-6630-201604011

TS254.9

A

1002-6630（2016）04-0062-06

周丹, 文連奎, 董周永, 等. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化河蚌肉工藝[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 62-67.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604011. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Dan, WEN Liankui, DONG Zhouyong, et al. Optimization of ultrasound-assisted papain treatment for tenderizatoin of freshwater mussel[J]. Food Science, 2016, 37(4): 62-67. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604011. http://www.spkx.net.cn

2015-06-08

長春市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展科技支撐計劃項目（13NK13）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點科技攻關(guān)項目（20150204034NY）

周丹（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：1174774559@qq.com

*通信作者：周亞軍（1966—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學(xué)與加工技術(shù)。E-mail：zhouruyilang@163.com