陳賢華，胡宏波，馮金，孫秀娟，劉大鷹

（廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院1.檢驗科，2.病理科，3.呼吸內(nèi)科，廣西 柳州 545007）

Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點多態(tài)性與肺癌發(fā)生的關聯(lián)*

陳賢華1，胡宏波1，馮金1，孫秀娟2，劉大鷹3

（廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院1.檢驗科，2.病理科，3.呼吸內(nèi)科，廣西 柳州 545007）

目的探討R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點單核苷酸多態(tài)性改變與肺癌發(fā)生的關系。方法基因分型用TAKAR A的MightyAmp DNA聚合酶法，分別檢測36例肺癌患者（癌癥組）和23例非癌患者（對照組）的R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C分布，運用χ2檢驗、Logistic回歸分析和Armitage's趨勢檢驗等分析基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡與肺癌發(fā)生的相關性。結(jié)果兩組標本經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測，對照組在R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C基因型觀測(理論)頻數(shù)為0，22，1（5.26，11.48，6.26），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）,癌癥組的基因型觀測(理論)頻數(shù)為6，29，1(11.67，17.65，6.67)，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；經(jīng)Logistic回歸分析，基因多態(tài)性、年齡是危險因素，基因多態(tài)性、年齡和吸煙與否在肺癌發(fā)生中不存在交互作用（P>0.05）；經(jīng)Armitage's趨勢檢驗差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.56，P=0.059）。結(jié)論R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點G>C單核苷酸位點多態(tài)性與肺癌發(fā)生具有一定的相關性。

肺癌；R eprimo；多態(tài)性；哈迪一溫伯格平衡

1 材料和方法

1.1臨床資料

36例肺癌和23例非癌對照組病例選自2006年1月-2012年12月廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院和外院手術切除或纖維支氣管鏡取得的肺（癌）組織，質(zhì)地良好，10%中性福爾馬林立即固定，石蠟包埋處理，室溫存檔至今；非癌對照組病例為肺支擴、肺擴張、非典型增生患者。

1.2提取DNA方法

選取TaKaRa DEXPAT試劑。肺（癌）組織加進PE管（切片厚度為5μm），0.3 ml TaKaRa DEXPAT提取液，恒溫加熱儀100℃加熱10 min，低溫離心機12 000 rpm，4℃離心10 min形成分液層，吸取水層就可得到PCR擴增用DNA。具體操作請參考說明書。

1.3擴增儀器和試劑

擴增儀器：伯樂MJ Mini擴增儀，試劑為TAKARA的MightyAmp DNA Polymerase試劑盒，正反向引物由上海生工合成,堿基序列為R1：5'-GCGCAGAACTTTGGAAGCTGC-3'；R2：5'-GCGC AGAACTTTGGAAGCTGG-3',R3：5'-AGGAGAAGAG TGGGAGCGC-3；R1R3針對839位點的G片段，擴增235bp產(chǎn)物；R2R3針對839位點的C片段，擴增235bp產(chǎn)物。

1.4PCR反應體系

有了第二個角的測量經(jīng)驗，對于第三個角，學生想到把45°的角再折小點，經(jīng)過幾番嘗試，發(fā)現(xiàn)把45°角進行三等分，每個角為15°，再用自制的量角工具進行第三次量角，得出待測角與正方形里的15°角的兩邊剛好重合，是15°。

反應體系為25μl:2×PCR Buffer 12.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板DNA 4μl，重蒸水7μl，酶（5 u/μl）0.5μl。反應條件：98℃預變性5min，擴增溫度98℃10 s、60℃15 s、68℃60 s，擴增循環(huán)40次，最后68℃延伸4 min；PCR擴增目的基因DNA的檢測：取10μl PCR產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗評估對照組和病例組中各基因型的分布差異，t檢驗評估年齡組差異，Logistic回歸分析多因素關系，以P=0.05為檢驗水準；哈迪一溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢測、Armitage's趨勢檢驗、計算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI），利用在線軟件（http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）進行計算，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1研究對象基本資料

收集肺癌患者36例。病理分組：小細胞癌組10例，大細胞癌組10例，腺癌組9例，鱗癌組7例；男性26例，平均（58.81±10.42）歲，女性10例，平均（54.40±9.58）歲，年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=1.161，P=0.254）。23例非癌對照患者，男性19例，平均（54.21±10.24）歲，女性4例，平均（50.00±6.16）歲，年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=0.784，P=0.442）。

2.2Reprimo基因分型和電泳

Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點各個基因型在瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶可為GG：235 bp；CC：235 bp；GC：235 bp。見附圖。

附圖　Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839 G>C位點基因型條帶圖譜

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗

各組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839G>C位點基因型頻數(shù)（觀測/理論）GG，GC，CC和Hardy-Weinberg檢驗具體見表1，判斷其符合Hardy-Weinberg平衡的標準為P>0.05。

表1　各組研究對象Hardy-Weinberg平衡檢測

2.4基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡對肺癌發(fā)生的影響

2.4.1單因素分析基因多態(tài)性與肺癌與否關系的χ2檢驗（χ2=6.394，P=0.041）；性別與肺癌與否關系的χ2檢驗（χ2=0.837，P=0.360）；吸煙與否與肺癌與否關系的χ2檢驗（χ2=1.639，P=0.200）；年齡與肺癌與否關系的χ2檢驗（χ2=1.532，P=0.131），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.4.2多因素Logistic回歸分析以基因多態(tài)性、吸煙與否和年齡為3個自變量，肺癌與否為因變量做Logistic回歸分析，B為回歸系數(shù)，Exp（B）為相對危險度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2　多因素Logistic回歸分析

2.5Reprimo 839位點多態(tài)性與各組肺癌易感性的Armitage's趨勢檢驗

攜帶C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌發(fā)病率低；攜帶GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌發(fā)病率更低，各肺癌組Armitage's趨勢檢驗情況具體見表3。

表3　各組肺癌Reprimo 839位點各基因模型Armitage's趨勢檢驗

3 討論

基因Reprimo是細胞周期調(diào)控蛋白，含有109個氨基酸，相對分子量為12 kD，定位于人類染色體2q23；是P53基因的下游靶基因，異位表達的P53可引起ReprimomRNA表達，其過表達可使細胞生長停滯于G2期其機制可能是通過抑制Cdc2/cyclinB1和Cdc2活性核轉(zhuǎn)位的途徑來調(diào)節(jié)細胞周期[6]。

現(xiàn)報道Reprimo基因甲基化與腫瘤關系的論文很多，認為其與腫瘤是否發(fā)生、治療方面存在一定的相關性[7-9]，而Reprimo基因多態(tài)性與腫瘤研究的報道較少，YE等在實驗中發(fā)現(xiàn)Reprimo基因3'非翻譯區(qū)的824位點存在G>C多態(tài)性，經(jīng)Hardy-weinberg平衡檢驗高加索人群，證明該位點基因型和等位基因頻率分布均符合遺傳平衡規(guī)律[10]。BEASLEY等[11]在研究Reprimo基因3'非翻譯區(qū)824位點G>C多態(tài)性與大腸癌的關系時，健康組和大腸癌組也證實在該位點符合遺傳平衡規(guī)律，但憩室病組不符合此平衡規(guī)律。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組和非癌對照組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因型和等位基因頻率分布不符合遺傳平衡狀態(tài)（P<0.05），但是肺癌病理分組中大細胞癌組、腺癌組、鱗癌組符合該規(guī)律（P>0.05）；小細胞癌組可認為接近符合遺傳平衡狀態(tài)（P=0.045）。各肺癌組之間的基因型差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.287，P=0.638）。不符合Hardy-weinberg平衡的原因可能是基因分型錯誤，也可能是基因缺失/突變，也可能是樣品數(shù)不足夠大。

在相同致癌條件下，暴露人群只有一部分人會得肺癌，病因?qū)W研究表明不同個體對致癌物的易感性是有差異性的；分子流行病學提示遺傳傾向?qū)Υ蠖鄶?shù)肺癌可能起到關鍵性作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否、年齡與肺癌發(fā)生與否作單因素分析時，基因多態(tài)性、年齡對肺癌發(fā)生與否有統(tǒng)計學意義（P<0.05），患者性別、吸煙與否對肺癌發(fā)生與否無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。因吸煙為肺癌的傳統(tǒng)危險因素，因此以基因多態(tài)性、吸煙與否和年齡為3個自變量，以肺癌與否為因變量做Logistic回歸分析，3者在肺癌發(fā)生中不存在交互作用（P>0.05），但基因多態(tài)性相對危險度最高，Exp（B）=5.369，說明基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生中起了重要作用。

BEASLEY等[11]研究Reprimo基因3'非翻譯區(qū)824位點G>C多態(tài)性與大腸癌的關系時，報道Reprimo基因824位點G>C多態(tài)性與大腸癌不存在相關性。本實驗結(jié)果顯示Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因改變，攜帶C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌發(fā)病率低；攜帶GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌發(fā)病率也明顯降低，Armitage's趨勢檢驗差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點基因改變，肺癌發(fā)生趨勢不是線性增加，但此處P=0.059，很接近0.05，可認為基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生還是具有一定相關性的，且在肺癌病理分組中大細胞癌、鱗癌與基因多態(tài)性存在相關性（P<0.05），腺癌、小細胞癌與基因多態(tài)性不存在相關性（P> 0.05）。

綜上所述Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點多態(tài)性與肺癌的發(fā)生具有一定相關性，尤其是攜帶G等位基因、GG基因型的患者更有可能發(fā)展成肺癌；基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡在肺癌發(fā)生中不存在交互作用，基因多態(tài)性相對危險度最高。由于本實驗樣本含量有限，且該位點基因不能解釋Reprimo基因所有位點的功能特性，在后續(xù)研究中有必要進一步擴大樣本含量和實驗，以期明確Reprimo基因單核苷酸多態(tài)性改變、基因類型與肺癌發(fā)生發(fā)展中關聯(lián)。

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（張蕾編輯）

Study of Reprimo 839 G＞C polymorphism and relationship with lung cancer*

Xian-huaChen1,Hong-boHu1,JinFeng1,Xiu-juanSun2,Da-yingLiu3
（1.Clinical laboratory，2.Pathology department，3.Respiratory medicine，Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital，Liuzhou，Guangxi 545007，China）

Objective To investigate the relationship between theReprimogene 3'-untranslated region 839 polymorphism and lung cancer.Methods Genotyping was performed with MightyAmp DNA Polymerase，a number of 36 lung cancer cases and 23 control cases were genotyped.The results of investigation were analyzed with χ2test，Logistic regression analysis and Armitage's trend test.Results According to Hardy-Weinberg equilibrium detection，Reprimo839 G＞C genotype observation（theory）frequency was 0，22，1（5.26，11.48，6.26）in the control group（with statistically significant difference，P=0.000）and 6，29，1（11.67，17.65，6.67）in the cancer group（with statistically significant difference，P=0.000）.Analyzed by Logistic regression analysis，gene polymorphism and age were risk factors，and there were no possible interactions among gene polymorphism，age，smoking status and lung cancer（P＞0.05）.Armitage's trend test revealed no statistically significant correlation between 839 G＞C polymorphism and susceptibility to lung cancer（χ2=3.56，P=0.059）.Conclusions This study indicates that there is a correlation between theReprimogene 3'-untranslated region 839 G＞C polymorphism and lung cancer.

lung cancer；reprimo；polymorphism；hardy-weinberg equilibrium

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.004

1005-8982（2016）20-0016-05

2016-02-23

柳州市科學技術局技術研究與開發(fā)計劃課題（No：2011J0302031）；廣西衛(wèi)生廳計劃課題（No：Z2010138）