吳莉，施東婧，李津源，杜洪印，喻文立，翁亦齊（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 3009）

隨著移植外科技術(shù)的發(fā)展，肝移植已成為終末期肝病最有效的治療手段。然而，肝臟缺血/再灌注損傷（IRI）是導(dǎo)致肝移植術(shù)后肝功能障礙及衰竭的重要影響因素。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡是引起肝臟 IRI的主要機(jī)制[1]。Ohsawa等[2]首次發(fā)現(xiàn)氫氣具有抗氧化和抗凋亡特性，通過(guò)選擇性中和羥自由基改善腦IRI和腦卒中，掀起了氫氣醫(yī)學(xué)研究的熱潮。作為一種新型抗氧化劑，氫氣已經(jīng)用于保護(hù)大鼠腦、心肌和腎IRI[3-5]。本研究擬評(píng)價(jià)飽和氫氣生理鹽水對(duì)大鼠肝臟冷IRI的影響。

1 材料和方法

1.1 飽和氫氣生理鹽水（HS）制備：在400 kPa壓力下將氫氣溶于生理鹽水6 h以達(dá)到飽和狀態(tài)，采用氣相色譜分析儀檢測(cè)生理鹽水中氫氣濃度，使其濃度大于0.6 mmol/L。制備的HS于4℃常壓保存，γ射線滅菌，并于24 h內(nèi)使用。

1.2 動(dòng)物選擇及分組：24只清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重為220～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組8只大鼠）：假手術(shù)組（Sham組）、肝臟冷缺血/再灌注組（I/R組）和飽和氫氣生理鹽水處理組（HS組）。

1.3 肝臟冷IRI模型的建立：大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛60 mg/kg麻醉，備皮后用安爾碘消毒，行腹正中切口入腹，依次游離肝下下腔靜脈、門靜脈、肝固有動(dòng)脈及肝上下腔靜脈，并結(jié)扎腎上腺靜脈，用無(wú)損傷血管夾夾閉肝固有動(dòng)脈、肝下下腔靜脈及門靜脈后，從門靜脈向肝臟方向注入1 ml肝素生理鹽水，使肝臟內(nèi)血液肝素化并沖回體循環(huán)。然后夾閉肝上下腔靜脈，此時(shí)全肝處于無(wú)血流狀態(tài)。在肝臟下腔靜脈剪開(kāi)1 mm開(kāi)口作為灌注液流出道，將4號(hào)輸液針扎入門靜脈并使用0～4℃乳酸林格液灌注肝臟，滴速維持在6～8 ml/min，壓力為10 kPa，冷灌注時(shí)間為30 min。停止灌注后，用8-0血管線縫合肝下下腔靜脈開(kāi)口及門靜脈穿刺點(diǎn)，然后松開(kāi)血管夾，肝臟血流恢復(fù)，檢查腹腔無(wú)異常后用溫生理鹽水沖洗后關(guān)腹。

1.4 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平測(cè)定：各組大鼠均于再灌注6 h后經(jīng)下腔靜脈抽取血樣4 ml，離心后留取上清液。采用全自動(dòng)生化分析儀（Roche公司，瑞士）檢測(cè)血清中ALT和AST水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清IL-10和TNF-α水平。

1.5 肝組織病理學(xué)觀察和丙二醛（MDA）及、超氧化物歧化酶（SOD）水平測(cè)定 ：取大鼠肝左葉組織，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋后制備病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色并于光鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)。取肝中葉組織制備10%組織勻漿，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)肝組織天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、Bcl-2及Bax的mRNA：采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)，表1為相關(guān)基因的引物序列。采用RNA提取試劑盒（Takara公司，日本）提取組織樣本總RNA。采用SYBR PrimeScriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒（Takara公司，日本）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體實(shí)驗(yàn)操作參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ擴(kuò)增試劑盒，分別利用caspase-3、Bcl-2及Bax的基因引物，使用ABI7300熒光定量PCR儀（Applied Biosystem，美國(guó)）進(jìn)行基因序列擴(kuò)增并分析處理數(shù)據(jù)。相對(duì)表達(dá)量用 2-△△Ct法計(jì)算。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能及血清炎癥因子改變（表2）：與Sham組相比，I/R組和HS組血清ALT、AST及TNF-α含量升高，I/R組血清IL-10含量降低，HS組IL-10含量升高（P＜0.05）。與I/R組相比，HS組血清ALT、AST及TNF-α含量均降低，血清IL-10含量升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肝功能及血清炎癥因子水平（±s）

表2 各組大鼠肝功能及血清炎癥因子水平（±s）

注：與HS組相比，aP＜0.05；與I/R組相比，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） ALT（U/L） AST（U/L）Sham 組 8 73.9±30.1 194.6±72.2 I/R組 8 467.3±203.6a 929.6±442.7a HS組 8 275.7±74.0ab 581.4±143.3ab組別 動(dòng)物數(shù)（只） TNF-α（μg/L） IL-10（μg/L）Sham 組 8 0.0 273±0.0 044 0.2 053±0.0 497 I/R組 8 0.0 813±0.0 298a 0.1 415±0.0 233a HS組 8 0.0 520±0.0 099ab 0.3 206±0.0 648ab

2.2 肝組織病理學(xué)改變（圖1）：Sham組肝組織未見(jiàn)明顯的病理學(xué)改變。I/R組肝細(xì)胞明顯腫大，偶見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變及點(diǎn)狀壞死，肝竇內(nèi)紅細(xì)胞淤積，部分肝血竇變窄或消失，肝小葉及匯管區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R組相比，HS組損傷程度較明顯減輕，肝細(xì)胞輕度腫脹，匯管區(qū)見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 再灌注6 h時(shí)大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變（HE×200）

2.3 肝組織氧化應(yīng)激及相關(guān)凋亡蛋白mRNA的表達(dá)情況（表3）：與Sham組相比，I/R組及HS組肝組織MDA含量、caspase-3及Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，SOD活性顯著降低（P＜0.05），HS組肝組織MDA含量、caspase-3及Bax/Bcl-2的mRNA水平比I/R組明顯降低，SOD活性較I/R組升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激及凋亡水平的比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激及凋亡水平的比較（±s）

注：與Sham組相比，aP＜0.05；與I/R組相比，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）Sham 組 8 0.84±0.06 240.8±16.9 I/R 組 8 1.13±0.10a 194.9±20.4a HS 組 8 1.00±0.11ab 218.1±16.0ab Bax/Bcl-2 mRNA（2-ΔΔCt）Sham 組 8 1.00±0.00 1.02±0.10 I/R組 8 2.77±0.98a 1.59±0.34a HS組 8 1.46±0.33ab 1.12±0.16ab組別 動(dòng)物數(shù)（只） caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）

3 討 論

本研究參照Nozato等[6]研究方法建立大鼠肝臟冷IRI模型，研究結(jié)果顯示，與S組相比，IR組ALT、AST及MDA水平升高，肝組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞變性及點(diǎn)狀壞死，而SOD活性降低，提示大鼠肝臟冷IRI模型制備成功。

氫氣是無(wú)色、無(wú)味、相對(duì)分子量最小的氣體，能迅速擴(kuò)散進(jìn)入線粒體、細(xì)胞核等亞細(xì)胞器，它們是活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生和DNA損傷的主要場(chǎng)所。氫氣選擇性減少羥自由基（·OH）和過(guò)氧亞硝基，而不清除具有生理功能的過(guò)氧陰離子（O-2）和過(guò)氧化氫（H2O2）[2]。本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-8]選擇于門靜脈阻斷前5 min經(jīng)下腔靜脈注射6 ml/kg飽和氫氣生理鹽水，結(jié)果表明飽和氫氣生理鹽水能夠明顯改善肝功能，減輕氧化應(yīng)激及病理?yè)p傷，提示飽和氫氣生理鹽水能夠顯著緩解肝冷IRI。

IRI是導(dǎo)致肝移植術(shù)后急性肝衰竭及移植物功能障礙的主要原因，其機(jī)制可能涉及細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基生成過(guò)多、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及微循環(huán)障礙等多種因素。缺血引起氧自由基積聚，并不斷消耗內(nèi)源性抗氧化劑。血液灌注恢復(fù)后，缺血組織進(jìn)一步產(chǎn)生大量氧自由基，并促使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而激發(fā)炎癥反應(yīng)，組織損傷加重，最終引起組織細(xì)胞凋亡。飽和氫氣生理鹽水可以減輕氧化應(yīng)激引起的過(guò)氧化損傷并且減少炎癥介質(zhì)的釋放，通過(guò)其抗氧化及抗炎癥效應(yīng)保護(hù)肝臟IRI[9]。氫氣通過(guò)抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡及炎癥反應(yīng)，從而減輕嚴(yán)重?zé)齻笤缙诩毙阅I損傷[10]。

本研究結(jié)果顯示，肝臟冷I/R后肝組織損傷嚴(yán)重，氧化應(yīng)激及炎癥因子的表達(dá)量升高，細(xì)胞凋亡明顯增加，活性氧自由基及炎癥因子對(duì)缺血部位產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，引起細(xì)胞凋亡及肝功能障礙。給予大鼠飽和氫氣生理鹽水后，肝功能明顯改善，肝組織病理?yè)p傷減輕，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)下降，細(xì)胞凋亡率減輕。因此，飽和氫氣生理鹽水可通過(guò)抑制肝臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)減輕細(xì)胞凋亡等途徑緩解大鼠肝臟冷IRI。

綜上所述，飽和氫氣生理鹽水通過(guò)其選擇性抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)及抗凋亡特性從而減輕肝臟冷IRI。