李春利 王孝敬 丁強(qiáng)強(qiáng) 吳 寒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095)

* 通信作者：E-mail:wuhan@ njau.edu.cn

毛白楊葉片再繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

李春利 王孝敬 丁強(qiáng)強(qiáng) 吳 寒*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095)

主要對(duì)毛白楊的葉片再繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)對(duì)影響組織培養(yǎng)效率的葉片分化方式、生根培養(yǎng)基、激素組合等因素的篩選和影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的外植體選材、菌液濃度兩個(gè)主要因素的研究，得出以下主要結(jié)果：葉片通過(guò)直接分化培養(yǎng)的方式，20 d即可形成叢芽；6-BA和TDZ(Thidiazuron)激素混合使用可促進(jìn)葉片分化，葉片分化率可達(dá)100%；增加芽伸長(zhǎng)步驟提高了單片葉的繁殖系數(shù)；生根培養(yǎng)基凝固劑使用水晶洋菜(Gelrite)代替瓊脂(Agar)，幼芽8 d即可生根，側(cè)根多、長(zhǎng)，有二級(jí)側(cè)根，根的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。對(duì)于轉(zhuǎn)化效率，不同莖段繼代數(shù)的葉片外植體均可用于進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但是繼代次數(shù)越多，轉(zhuǎn)化效率越低，選擇初代培養(yǎng)植株的葉片作外植體，愈傷形成率83.5%，陽(yáng)性植株得率100%，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)55%以上。這是一種明顯不同于已發(fā)表過(guò)的具有高效率的毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化方法。葉片再繁采用直接分化方式，6-BA和TDZ激素混合使用和增加芽伸長(zhǎng)步驟，提高了葉片的組織培養(yǎng)效率；生根培養(yǎng)基使用水晶洋菜做凝固劑，無(wú)需添加促進(jìn)生根的激素，有利于植株生長(zhǎng)；初代培養(yǎng)植株的葉片外植體，更適合毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化。

毛白楊；葉片再繁；遺傳轉(zhuǎn)化；TDZ

毛白楊(PopulustomentosaCarriere)是我國(guó)特有的速生樹(shù)種之一，樹(shù)形高大，樹(shù)姿優(yōu)美，是北方普遍栽植的庭園綠化或行道樹(shù)，是集觀賞與用材于一身的優(yōu)良樹(shù)種。毛白楊作為木本植物具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、遺傳背景復(fù)雜的特點(diǎn)，利用傳統(tǒng)育種技術(shù)會(huì)受到生物體間親緣關(guān)系的制約，并因?yàn)槠洳僮鲗?duì)象是整個(gè)基因組，使得目的性狀的隨機(jī)組合難以控制。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有目的性強(qiáng)、可操作性高、縮短育種周期等優(yōu)點(diǎn)[1]，已成為解決多細(xì)胞生物中重要生物學(xué)問(wèn)題的一個(gè)強(qiáng)大工具，尤其是高等植物[2]。

如今許多新的育種方法都可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而組織培養(yǎng)再生是多數(shù)植物能高效轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行毛白楊無(wú)性繁殖具有保持其優(yōu)良特性、擴(kuò)大繁殖系數(shù)、縮短育種周期、商業(yè)可行性高等優(yōu)點(diǎn)[3]。組織培養(yǎng)多應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝工業(yè)化等方面[4]，在植物基因工程改良中發(fā)揮著重要作用。毛白楊組織培養(yǎng)效率的提高受許多因子的影響，如外植體、培養(yǎng)基、外源激素等，通過(guò)對(duì)其影響因子的優(yōu)化，以獲得最佳的組培效果。本文對(duì)毛白楊葉片再繁方式、生根培養(yǎng)基和激素組合進(jìn)行了篩選，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化的外植體選材、菌液濃度等因素進(jìn)行了優(yōu)化，明顯提高了毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

1 材料

1.1 植物材料

取毛白楊嫩枝萌芽經(jīng)初代培養(yǎng)獲得組培無(wú)菌苗。

1.2 菌種

遺傳轉(zhuǎn)化使用T01質(zhì)粒載體，質(zhì)粒攜帶有35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS：NPT Ⅱ融合基因和Kan基因。毛白楊轉(zhuǎn)化使用農(nóng)桿菌菌株EHA105。

1.3 試劑和酶

主要的實(shí)驗(yàn)試劑和酶：預(yù)混型DNA聚合酶(Primix Taq version 2.0)(TaKaRa公司)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Ladder Marker)(廣州東盛生物科技有限公司)；植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN公司)；卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、乙酰丁香酮(AS)、特美汀(Ti)(南京壽德公司)；引物合成由南京金斯瑞生物科技公司合成。

2 方法

2.1 建立葉片再繁體系

采用直接分化培養(yǎng)和經(jīng)愈傷培養(yǎng)、分化培養(yǎng)出芽的方式進(jìn)行葉片再繁，各培養(yǎng)基激素配比如表1。選取生長(zhǎng)良好的無(wú)菌苗葉片，剪成1.0～1.5 cm大小的葉塊，設(shè)計(jì)3種不同分化培養(yǎng)基，通過(guò)觀察葉塊不定芽分化的情況，選擇出分化狀態(tài)最好的培養(yǎng)基。20 d左右分化出叢芽，連帶愈傷切下轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基。

計(jì)算3種培養(yǎng)基的分化率和繁殖系數(shù)：

分化率=分化出芽的葉塊數(shù)/葉塊總數(shù)

(1)

繁殖系數(shù)指叢芽轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基10 d后，以大于1.0 cm的可接芽作為有效芽計(jì)算繁殖系數(shù)：

繁殖系數(shù)=芽的個(gè)數(shù)/葉塊總數(shù)

(2)

選取50個(gè)葉塊計(jì)算分化率，3次重復(fù)，并隨機(jī)選取20個(gè)葉塊計(jì)算繁殖系數(shù)。

表1 各培養(yǎng)基激素組分

2.2 生根培養(yǎng)基的篩選

生根培養(yǎng)基分別添加水晶洋菜2.6 g·L-1和瓊脂7.2 g·L-1，并分別加入0.4 mg·L-1IBA、0.1 mg·L-1NAA的生長(zhǎng)素。觀察根的生長(zhǎng)狀態(tài)，并記錄生根時(shí)間和不定根及一級(jí)側(cè)根的根數(shù)及總根長(zhǎng)。

2.3 葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法優(yōu)化后的主要步驟

選取生長(zhǎng)良好，植株健壯的初代培養(yǎng)(由芽再生得到的植株)組培苗，選用生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的完全展開(kāi)葉片，剪成1.0～1.5 cm大小的葉塊；農(nóng)桿菌侵染菌液搖至OD600值0.3左右，5 000 r·min-1離心5 min，用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基懸浮1 h，然后28℃，100 r·min-1侵染10～12 min；將葉塊用無(wú)菌濾紙吸干轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+200 μmol·L-1AS)，暗處共培養(yǎng)3 d；之后將葉片轉(zhuǎn)移到愈傷培養(yǎng)基(MS+2.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+150 mg·L-1Ti+40 mg·L-1Kan)，2 000 lx左右的弱光下培養(yǎng)15 d；葉片轉(zhuǎn)移到同樣含Ti和Kan的分化培養(yǎng)基(MS+0.4 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1IBA)；30 d左右分化出芽，轉(zhuǎn)入含Ti和Kan的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(MS+0.4 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA)；芽伸長(zhǎng)2 cm左右轉(zhuǎn)入含Ti和Kan的1/2MS生根培養(yǎng)。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因植株采用GUS染色和DNA PCR驗(yàn)證判斷目的基因是否導(dǎo)入，對(duì)照為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的毛白楊。GUS染色選擇2～3 cm的轉(zhuǎn)基因幼芽，剪取葉片外植體置于X-Gluc染色液中，37℃水浴過(guò)夜，95%乙醇脫色3次，鏡檢觀察。DNA PCR驗(yàn)證的特異性引物序列為：

上游引物：5′ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC3′；

下游引物：5′TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG3′，克隆長(zhǎng)度2 658 bp。PCR反應(yīng)程序(20 μL的反應(yīng)體系)：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

3 結(jié)果

3.1 葉片再繁體系的建立

葉塊直接分化培養(yǎng)20 d左右，叢芽即可轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，而經(jīng)愈傷再分化培養(yǎng)形成叢芽則需40 d左右，所需時(shí)間較長(zhǎng)。從表2中可以看出，3種分化激素處理的葉塊分化率差異不顯著，都可達(dá)到90%以上，6-BA和TDZ的混合使用未能明顯提高分化率。形成的叢芽連帶愈傷轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)，與在平板里分化相對(duì)比(圖1)，大大提高葉塊的繁殖系數(shù)，培養(yǎng)基三平板培養(yǎng)平均每個(gè)葉塊3.4株幼芽，芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)每個(gè)葉塊平均10.1株。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TDZ促進(jìn)芽的分化要強(qiáng)于其他分裂素，但抑制芽的伸長(zhǎng)[5]，因此增加芽伸長(zhǎng)這一步驟能消除TDZ對(duì)芽伸長(zhǎng)的抑制，提高毛白楊的繁殖系數(shù)。

表23種分化培養(yǎng)基的分化率和繁殖系數(shù)

Table2Thedifferentiationratesandpropagationcoefficientofleafblocksinthreedifferentiationmediums

分化培養(yǎng)基Differentiationmedium分化率Differentiationrate(%)每葉塊繁殖系數(shù)Propagationcoefficientofperleafblocks平板培養(yǎng)(株)Plateculture芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)(株)Shootelongationculture培養(yǎng)基一Medium192.0±2.0a2.2±0.9a5.5±1.3b培養(yǎng)基二Medium294.7±2.3a3.0±1.1b6.9±1.6c培養(yǎng)基三Medium397.3±3.1a3.4±1.1b10.1±1.9a

注：同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)；繁殖系數(shù)同行小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Significant differences were denoted with different small letters(P<0.05) in the same column and propagation coefficient in the same line.

圖1 葉片分化20 d的狀態(tài)(A)和將分化出的幼芽連帶愈傷移入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(B)Fig.1 Leaf differentiated for 20 d(A),the differentiated buds and callus were transferred to shoot elongation medium(B)

圖2 水晶洋菜(A)與瓊脂培養(yǎng)基(B)根生長(zhǎng)狀態(tài)的對(duì)比Fig.2 Comparing of the root growth state between gelrite(A) and agar(B) culture mediums

3.2 生根培養(yǎng)基的篩選

由表3～4可看出，幼芽在以水晶洋菜做凝固劑的培養(yǎng)基中生根快，一周左右即可生根，與瓊脂培養(yǎng)基相比不定根數(shù)量無(wú)明顯差異，一級(jí)側(cè)根的數(shù)量和長(zhǎng)度明顯高于瓊脂培養(yǎng)基，且有二級(jí)側(cè)根，根的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)；而在瓊脂培養(yǎng)基需兩周左右生根，根易發(fā)黃、老化(圖2)。是否添加激素對(duì)生根的影響不大，考慮到植株不宜長(zhǎng)期生長(zhǎng)在含外源激素的環(huán)境中，生根培養(yǎng)基選擇不添加任何激素的1/2MS(水晶洋菜)培養(yǎng)基中。

表3不同生根培養(yǎng)基中幼芽的生根時(shí)間

Table3Timeforrootingofshootsondifferentrootingmediums

激素處理Hormonetreatment水晶洋菜培養(yǎng)基Gelritemedium(d)瓊脂培養(yǎng)基Agarmedium(d)07～813～150.4mg·L-1IBA6～79～110.1mg·L-1NAA6～810～11

表4 凝固劑對(duì)幼芽生根的影響

注：同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05 )。

Note:Different superscripts of small letters in the same column show significant difference(P<0.05).

3.3不同莖段繼代數(shù)葉片外植體和侵染菌液濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化采用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法。葉片進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染時(shí)發(fā)現(xiàn)，若菌液濃度超過(guò)一定OD值，OD值越高，后期長(zhǎng)菌時(shí)間越早，通過(guò)洗菌處理進(jìn)行脫菌很難抑制，且重復(fù)洗菌過(guò)程對(duì)葉塊傷害較大，造成葉片黃化、難以分化，如初代葉片外植體使用OD600=0.4的菌液侵染，45 d左右長(zhǎng)菌，使用OD600=0.5的菌液侵染，15 d左右即大量長(zhǎng)菌，重復(fù)洗菌使得轉(zhuǎn)化葉片黃化、更難分化；不同莖段繼代數(shù)葉片外植體對(duì)侵染菌液濃度的耐受性不同，初代葉片侵染菌液最適OD值0.3左右，繼代1～2次葉片侵染菌液最適OD值0.4～0.5，多次繼代(>8)葉片侵染菌液最適OD值0.7左右，表現(xiàn)出莖段繼代數(shù)越多，所適應(yīng)的菌液濃度越高；侵染時(shí)選擇合適的菌液濃度和侵染時(shí)間，后期不需要重復(fù)洗菌(表5)。

表5不同莖段繼代次數(shù)的植株葉片外植體對(duì)菌液濃度的適應(yīng)性

Table5Theadaptabilityofdifferentsubculturedleafexplantsondifferentbacterialconcentrations

OD60000.20.30.40.50.60.70.8初代葉片Primarycultureleaf---+(葉片多不分化,45d左右染菌)(Mostoftheleaveswereundifferentiated,bacteriaappearedafterabout45d)+(葉片不分化,15d左右染菌)(Theleaveswereundif-ferentiated,bacteriaap-pearedafterabout15d)++++++繼代<3次Subculture<3----+(部分正常分化,后期少量染菌)(Partoftheleavesweredifferentiation,andalit-tlebacteriaappeared)++++++繼代>8次Subculture>8-------+

注:+.表示農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；-.表示農(nóng)桿菌未生長(zhǎng)

Note:+.Show agrobacterium growth;-.Show without agrobacterium growth

表6 莖段繼代次數(shù)對(duì)植株葉片外植體的陽(yáng)性植株比率和轉(zhuǎn)化效率的影響

從轉(zhuǎn)化獲得的抗性植株中陽(yáng)性植株所占的百分比作為陽(yáng)性植株比率；總的葉塊數(shù)中可分化出陽(yáng)性芽的葉塊數(shù)(每個(gè)葉塊取單株芽)所占的百分比作為轉(zhuǎn)化效率。通過(guò)表6可以明顯看出，不同莖段繼代數(shù)葉片外植體的轉(zhuǎn)化效率相差很大，初代葉片轉(zhuǎn)化效率高達(dá)55%，繼代1～2次葉片轉(zhuǎn)化效率僅11.04%，多次莖段繼代的葉片很難轉(zhuǎn)化成功，選擇初代葉片外植體進(jìn)行毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性植株比率和轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于多次莖段繼代植株的葉片外植體。采用初代培養(yǎng)的植株葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，侵染菌液OD值0.3左右，葉片轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，后期不需要洗菌處理，愈傷形成率可達(dá)83.5%，陽(yáng)性植株比率高達(dá)100%，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)55%以上。

3.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

通過(guò)GUS染色和DNA PCR的方法檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因植株葉片通過(guò)GUS染色后均能顯現(xiàn)藍(lán)色(圖3:B)，同時(shí)通過(guò)PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)GUS基因的抗性植株均能擴(kuò)增出目的條帶(大約為2 500 bp)(圖3:C)，因此可初步判斷目的基因已導(dǎo)入毛白楊。

圖3 轉(zhuǎn)基因幼苗(A)，幼芽GUS染色結(jié)果(B)及DNA PCR結(jié)果(C) M. Marker；CK.非轉(zhuǎn)基因植株；1～8.轉(zhuǎn)基因植株Fig.3 The transgenic seedlings(A),results of shoots GUS staining(B) and DNA PCR(C) M. Marker; CK. for non-transgenic plants; 1-8.Transgenic plants

4 討論

4.1 葉片再繁體系的優(yōu)化

葉片再繁采用直接分化的方式，很好的解決了經(jīng)愈傷組織再分化不定芽獲得完整植株所需時(shí)間較長(zhǎng)、培養(yǎng)程序復(fù)雜的問(wèn)題。TDZ已經(jīng)應(yīng)用于多種植物的組織培養(yǎng)，如小地榆[6]、魁芋[7]、香椿[8]、牡丹[9]、棗樹(shù)[10]等。Song J Y等和陳宗禮等在文中提到多種激素的混合使用的效果要優(yōu)于單個(gè)激素的使用，并且與6-BA的混合使用誘導(dǎo)芽分化時(shí)，用低濃度的TDZ代替價(jià)格昂貴的玉米素ZT，可達(dá)到或超過(guò)玉米素的效果[10～12]。低濃度的TDZ能夠誘導(dǎo)叢生芽，而高濃度TDZ會(huì)導(dǎo)致芽畸形或者不生長(zhǎng)[6]，低濃度的TDZ不易使幼苗玻璃化[13]，毛白楊葉片再繁體系幼苗玻璃化率為0%，但在遺傳轉(zhuǎn)化中存在玻璃化，玻璃化率可達(dá)3.7%(2/53)，如何降低或消除遺傳轉(zhuǎn)化中的玻璃化現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。增加芽伸長(zhǎng)這一步驟能消除TDZ抑制芽生長(zhǎng)的影響，并提高了毛白楊葉片的繁殖系數(shù)。培養(yǎng)基凝固劑用水晶洋菜代替瓊脂可促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)及向胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化[14]，生根培養(yǎng)基使用水晶洋菜代替瓊脂，縮短了生根時(shí)間，側(cè)根多、長(zhǎng)，根的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，有利于根系吸收營(yíng)養(yǎng)，加快植株生長(zhǎng)。

4.2 影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素

許多已發(fā)表的有關(guān)毛白楊轉(zhuǎn)化文章中所述葉片侵染菌液最適OD值和轉(zhuǎn)化效率差別較大，如Yang M S等在文中提到侵染菌液搖過(guò)夜，毛白楊的陽(yáng)性植株比率可達(dá)到80%，而轉(zhuǎn)化效率僅為18%[15]；Li M等通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，侵染菌液OD600=0.4～0.6，毛白楊葉片轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到36.9%[16]；龍萃等轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化后的菌液OD600=0.3～0.5，但毛白楊陽(yáng)性植株比率僅達(dá)到20.9%，轉(zhuǎn)化效率為9.38%[17]；Du N X等在文章中提到侵染菌液OD600=0.6～0.8[18]；Jia Z C等菌液OD值0.8左右[19]；本研究轉(zhuǎn)化采用初代培養(yǎng)的植株葉片作為外植體，侵染菌液OD值0.3左右，陽(yáng)性植株比率高達(dá)100%，每個(gè)轉(zhuǎn)化葉塊取單株芽，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)55%以上，若取轉(zhuǎn)化葉塊的全部芽，將會(huì)大大增加毛白楊陽(yáng)性植株的數(shù)量。毛白楊轉(zhuǎn)化相關(guān)文章對(duì)葉片外植體選擇的植株材料描述不詳，根據(jù)在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同莖段繼代數(shù)的葉片外植體的侵染最適OD值和轉(zhuǎn)化效率相差很大，多次繼代的葉片外植體很難轉(zhuǎn)化成功，并且侵染最適OD值偏高，可高達(dá)0.7左右，使用初代培養(yǎng)的葉片外植體侵染OD值偏低，只有0.3左右，推測(cè)原因可能是選擇葉片外植體的植株材料不同所致。外植體的年齡和生理狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響，選擇處于不同年齡、不同生理狀態(tài)的外植體對(duì)農(nóng)桿菌的耐受性不同[20]，含有活躍細(xì)胞分裂的外植體對(duì)農(nóng)桿菌的侵染較為敏感；幼嫩組織可能含有較少的抑制因子等因素[21～22]，使得初代培養(yǎng)的葉片外植體最易轉(zhuǎn)化，具體原因仍需更深入的探索與研究。當(dāng)選擇合適的菌液濃度和侵染時(shí)間時(shí)，轉(zhuǎn)化葉片的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，后期不需要重復(fù)洗菌，不僅簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，節(jié)省時(shí)間，而且減少重復(fù)洗菌對(duì)轉(zhuǎn)化葉片的傷害，提高了毛白楊轉(zhuǎn)化效率。

毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化多采用Kan抗性篩選和頭孢噻肟、羧芐青霉素等抑制農(nóng)桿菌。Kan篩選多為25 mg·L-1[19]、30 mg·L-1[16]一次篩選或是30 mg·L-1(20 mg·L-1)、50 mg·L-1分兩次進(jìn)行篩選[17～18,23]。本研究中選擇40 mg·L-1的Kan篩選壓一次篩選，使得陽(yáng)性植株比率可達(dá)100%，幼芽生根率100%，表明40 mg·L-1的Kan足夠?qū)γ讞钷D(zhuǎn)化植株進(jìn)行抗性篩選。Ti抑制農(nóng)桿菌的效果良好，比頭孢噻肟和羧芐青霉素對(duì)葉片的傷害要小[24～25]，使用150 mg·L-1的Ti抑制農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化葉片生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且不易長(zhǎng)菌。

楊樹(shù)是研究林木遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物。提高毛白楊葉片的分化率、再繁系數(shù)和轉(zhuǎn)化效率，為毛白楊的品種改良和培育新品種奠定了基礎(chǔ)，并為其他林木樹(shù)種的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了新的切入點(diǎn)和奠定基礎(chǔ)。

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OptimizationofLeafRegenerationandGeneticTransformationSystemofPopulustomentosa

LI Chun-Li WANG Xiao-Jing DING Qiang-Qiang WU Han*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095)

The experiment was conducted to optimize leaf regeneration and genetic transformation ofPopulustomentosa, and performed to select best leaf regenerative method, rooting medium, with an emphasis on hormone combination and compositions, and to select best explants and Agrobacterium concentration. We demonstrated that twenty days were needed for generation of cluster buds through direct differentiation of leaf tissues. With the mixed hormones of 6-BA and TDZ, we observed the 100% leaf differentiation. Further, the propagation coefficient of single leaf was improved by the step of shoot elongation. We also drastically improved root initiation and growth if gelrite was used when compared to commonly used agar, judging with the number and the length of the roots, and the shoots can root for about eight days. For genetic transformation efficiencies, our experiment showed that leaf explants after numerous subcultures can be infected by Agrobacterium but the transformation efficiency was reduced, if the primary cultured leaves were selected as explants and the concentration of bacteria liquid was OD600=0.3, transgenic callus formation was greater than 83.5%, all shoots survived the antibiotic selection were 100% transgenic, and the transformation efficiency was more than 55%. We report a highly efficient genetic transformation method forP.tomentosa, it is significantly different from the previously published methods. The regeneration of leaf discs through direct differentiation, the mixed use of hormone 6-BA and TDZ, and the step of shoot elongation can improve the efficiency of leaf tissue culture, also using gelrite as the coagulant in rooting medium without the addition of hormone promotes the initiation and growth of roots, and improves the plant growth as well. The primary cultured leaves are more suitable for genetic transformation ofP.tomentosa.

Populustomentosa;leaf regeneration;genetic transformation;TDZ

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)自主創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(KYZ201309)；作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(ZW2014008)

李春利(1990—)，女，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種工作。

2015-09-29

S792.117

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.004