羅飛亞，王鋼力，邢書霞，蘇哲，王佑春

化妝品安全性評價替代試驗的研究進展及思考

羅飛亞，王鋼力，邢書霞，蘇哲，王佑春

化妝品的安全性評價是保障化妝品質(zhì)量安全的重要環(huán)節(jié)。在我國，化妝品作為一種健康相關產(chǎn)品，實行上市前產(chǎn)品的許可備案管理制度［1-2］。我國的化妝品安全性評價體系包括：經(jīng)典的毒理學試驗、體外遺傳毒性試驗和人體安全性試驗。像眼刺激性、皮膚刺激性、皮膚致敏性等化妝品安全性評價中關鍵的毒理學終點，以整體動物試驗為主［3］。

1959 年，英國科學家首先提出動物福利和動物保護的“3R”（reduction、refinement、replacement）原則，即在科學研究中不斷減少、優(yōu)化、替代動物試驗［4］。隨著科技的不斷進步，細胞、分子等生物學手段被引入到現(xiàn)代毒理學研究中，新的體外研究方法如計算機模擬毒性當量、體外重建的組織器官、人的永生化細胞系等檢測方法在逐步替代傳統(tǒng)的動物實驗［5-6］。近年來，非動物檢測方法的呼聲越來越高，尤其是在化妝品安全性評價中。從科學的角度來看，動物皮膚及角膜無論在生物學構(gòu)造還是生理功能方面都與人的皮膚和角膜存在差異，以動物試驗模擬人實際使用化妝品的情況存在種屬間的偏差；某些局部毒性的經(jīng)典毒理學試驗如眼刺激、皮膚刺激性（腐蝕性）的家兔試驗，檢測方法的評分標準較為主觀，不如體外的人工角膜、人工皮膚模型的結(jié)果精準客觀［7-9］。從法規(guī)要求來看，隨著歐盟化妝品動物試驗禁令的實施，使用非動物試驗進行化妝品安全評估成為了越來越多的國家和地區(qū)努力實現(xiàn)的目標。

1 不同國家、地區(qū)的體外替代方法起源及管理現(xiàn)狀

2003 年 1 月，歐盟規(guī)定：自 2009 年 3 月 11 日起禁止使用動物進行化妝品急性毒性、眼刺激和過敏試驗，自2013 年 3 月 11 日起全面禁止在動物身上進行化妝品和原料的安全性測試，不允許成員國從外國進口和銷售違反上述禁令的化妝品，并列入 WTO 雙邊協(xié)議。這一動物實驗禁令的提出，加快了全世界在化妝品領域?qū)μ娲椒ㄑ芯康牟椒ァ?/p>

美國自 20 世紀開始的國家毒理計劃（national toxicology program，NTP）也一直致力于毒理檢測方法的改進和研究。其“21 世紀毒性試驗：遠景與策略”報告中指出傳統(tǒng)的毒理學正經(jīng)歷著巨大的挑戰(zhàn)和改革，未來的毒性檢測策略將以研究毒性機制和靶向測試為核心，方法逐漸由當前的體內(nèi)試驗轉(zhuǎn)變?yōu)轶w外試驗，重點發(fā)展以現(xiàn)代生物學為基礎、涵蓋廣泛量效關系的、高效的體外測試方法［10］。

2009 年，美國、加拿大、日本和歐盟簽署了替代方法國際合作協(xié)議（International Cooperation on Alternative Test Methods，ICATM），2011 年韓國也加入了該協(xié)議。此后幾年內(nèi)，歐盟、美國、日本、韓國、巴西等國家和地區(qū)都紛紛成立了相應的體外科學研究中心，如美國機構(gòu)間替代方法評價協(xié)調(diào)委員會（ICCVAM）、歐盟歐洲替代動物方法核心實驗室（EURL-ECVAM）以及日本替代試驗驗證中心（JaCVAM）等。經(jīng)過替代方法驗證中心認可的試驗方法，可以申請納入世貿(mào)經(jīng)合組織（OECD）、人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）、國際化妝品監(jiān)管合作組織（ICCR，主要參與成員包括美國、歐盟、日本和加拿大的相關職能機構(gòu)）或其他國家、地區(qū)的法規(guī)標準，在世界范圍內(nèi)被廣泛認可。迄今為止，世界上已經(jīng)明令禁止或正在討論禁止化妝品動物試驗的國家和地區(qū)有：歐盟、英國、挪威、巴西、土耳其、韓國、印度、新西蘭、以色列、瑞士、美國、俄羅斯、澳大利亞、加拿大、阿根廷、越南和中國臺灣等。有些國家雖未立法禁止動物試驗，但是設立了專門的替代方法研究中心，比如日本。有些國家雖未設立專門的替代方法研究中心，但其政府部門有專門的科研經(jīng)費和基金用于替代試驗相關的研究，或者通過跨國合作的方式與美國、歐盟的替代試驗研究中心合作，進行替代方法的驗證和研究，或者通過網(wǎng)絡平臺分享和交流替代方法，比如加拿大、德國、澳大利亞和新西蘭。

從化妝品禁令的模式來看，有像歐盟禁令這樣一刀切式的全面禁止化妝品及原料領域中所有動物試驗的模式，也有根據(jù)科學的發(fā)展，只在有其他優(yōu)選方案的情況下禁止動物試驗的模式。還有很多國家雖無法規(guī)要求禁止動物試驗，但在化妝品安全評價中可自由選擇是否采用替代方法。

2 體外替代方法的研究進展及使用策略

需要指出的是，所謂的“替代方法”，是對英文“alternative methods”的直接翻譯，但其意義應該是指“最優(yōu)選的方法”，而不僅僅是追求“替代”原有的動物試驗。研究“化妝品動物體外替代試驗”，是為了尋找更精確、一致性更高、更靈敏、更經(jīng)濟的優(yōu)選方法，并且這些“優(yōu)選方法”首先需要符合動物“3R”的減少、優(yōu)化、替代原則。

歐盟的聯(lián)合研究中心（JRC）和美國的國家毒理計劃（NTP）均一直致力于替代試驗的開發(fā)、驗證和推廣工作。替代試驗的研發(fā)思路由最開始的以離體器官、屠宰場廢料、雞胚等取代整體動物的方法，發(fā)展至體外細胞系試驗、重建人體組織（眼角膜、皮膚模型）為研究對象的方法，再發(fā)展至以微生理為基礎的“human-on-chips”或者稱為“l(fā)ab-on-chips”的芯片技術，以及以計算機技術為基礎的定量構(gòu)效關系（QSAR）。

化妝品安全性評價中，經(jīng)過驗證的評價局部毒性替代方法較多，包括皮膚刺激（腐蝕）性、眼刺激（腐蝕）性、皮膚光毒性、皮膚致敏性等，可以實現(xiàn)通過單一方法或幾種替代方法組合的策略評價化妝品及其配方、原料的安全性，且在評價過程中完全不使用整體動物試驗。但是在全身毒性試驗方面（遺傳毒性、致癌性、胚胎毒性等），至今還沒有可以完全取消動物試驗的策略，尤其是亞急性和長期毒性的評估中，仍然依賴整體動物試驗來提供可靠的數(shù)據(jù)。根據(jù)替代方法的研究和使用經(jīng)驗，科學界逐步形成了根據(jù)特定的毒理學終點，“自上而下”或“自下而上”地有序選擇一系列試驗形成“組合策略”，達到有效篩選毒性的目的。例如評價一個受試物的眼刺激性，可以從評價腐蝕性的試驗開始，一直測到評價刺激性的試驗結(jié)束，或反過來檢測。組合策略可以高效快速地篩選出結(jié)果，也可以彌補單一試驗的局限性問題。近一兩年的 OECD 化學品檢驗指南中，每一個試驗更新版的名稱由原來僅有方法名稱調(diào)整為增加試驗目的及適用條件的形式［11］，更加方便進行選擇。

3 體外替代方法的驗證和使用情況

美國 ICCVAM、歐盟 ECVAM、日本 JaCVAM 和OECD 化學品檢驗指南的官方網(wǎng)站上收錄了一系列的體外方法，我們對其中適用于化妝品的安全評價的試驗驗證進展進行了總結(jié)，其具體內(nèi)容見表 1。

3.1 眼刺激（腐蝕）性試驗

眼部毒性的試驗方法研究的很多，可用的替代方法也很多。OECD 認可的試驗就有 5 個：牛眼角膜滲透性通透性試驗（BCOP）［12］、離體雞眼試驗（ICE）［13］、細胞培養(yǎng)型的熒光素滲漏試驗（FL）［14］、體外短時間暴露試驗［15］、重組人角膜組織試驗［16］，還有一個正在驗證中的細胞傳感器微生理儀試驗（CM）。除 OECD 和美國已經(jīng)驗證的方法外，歐盟 ECVAM 驗證過的方法還有雞胚尿囊膜-絨毛膜試驗（HET-CAM）、紅細胞溶血法（RBC）、中性紅釋放法和離體兔眼法。目前，國際上最常用的方法是 BCOP，但由于東方人的飲食習慣和宗教信仰等原因獲取牛角膜有一定難度，加上科學研究發(fā)現(xiàn)，豬眼角膜在生理及反應結(jié)果方面與人角膜更為接近，因此也開始有利用豬眼角膜進行滲透性通透性試驗的研究［17-19］。

眼刺激（腐蝕）性試驗中，單一的替代方法是無法完全涵蓋整體動物試驗所適合的所有刺激性等級范圍以及所有種類的物質(zhì)和產(chǎn)品的，也無法覆蓋動物試驗的損傷及炎癥的標準范圍。由于每一個替代方法均有其局限性，因此通常采用組合策略，來實現(xiàn)完全覆蓋動物試驗所顯示的刺激性范圍［6］。

眼刺激（腐蝕）性的替代方法研究思路從最初的離體眼球類的試驗（離體兔眼、離體雞眼）發(fā)展到利用屠宰場廢料的 BCOP 試驗，從模擬眼睛毛細血管網(wǎng)絡的雞胚尿囊膜-絨毛膜試驗，發(fā)展到體外細胞系試驗（熒光素滲漏試驗、短時暴露試驗、細胞傳感微生理試驗）再到體外重組人體角膜試驗，其發(fā)展歷程充分體現(xiàn)了減少、優(yōu)化、替代的“3R”原則。

3.2 皮膚刺激（腐蝕）性試驗

目前，OECD 認可的皮膚刺激（腐蝕）性的替代試驗只有 3 類：大鼠經(jīng)皮電阻試驗（TER）［20］、體外皮膚刺激性和腐蝕性的重組人表皮模型試驗（RHE）［21-22］和體外皮膚腐蝕性膜屏障試驗［23］。其中人工皮膚模型類的試驗因其使用的試驗材料為體外培養(yǎng)的人永生化細胞系，模擬表皮和真皮的生理結(jié)構(gòu)進行培養(yǎng)，所以結(jié)果與人體結(jié)果的相關度較高，很多化妝品企業(yè)選擇皮膚模型進行產(chǎn)品的研發(fā)和質(zhì)量控制，為了可以篩選到刺激性更小的產(chǎn)品，如嬰兒無淚沐浴產(chǎn)品等。但 OECD 的標準中認可的皮膚模型僅有 4 種（Episkin、EpiDerm、SkinEthic 和 epiCS）［21-22］，均為國外生產(chǎn)的，如在我國使用，培養(yǎng)和運輸成本將提高。由于皮膚模型屬于生物活性材料，運輸和使用的日期將直接影響檢測結(jié)果的準確性。體外皮膚腐蝕性膜屏障試驗主要用于評價可透皮吸收的化妝品原料的腐蝕性。大鼠經(jīng)皮電阻試驗方法（TER）可以滿足評價皮膚腐蝕性的需要，但因為其試驗材料是實驗大鼠的背部皮膚，因此該方法只能算對傳統(tǒng)動物試驗的優(yōu)化，不能滿足化妝品動物試驗禁令的法規(guī)要求。

3.3 皮膚致敏性試驗

皮膚致敏性的替代試驗主要有 OECD 于 2010 年發(fā)布的一系列小鼠局部淋巴結(jié)細胞試驗（LLNA、LLNA：DA、LLNA：BrdU-ELISA）［24-25］，以及 2015 年新增加的兩個體外方法——致敏性化學測試方法（KeratinoSens）［26］和體外直接反應肽試驗（DPRA）［27］。在 2015 年以前，小鼠局部淋巴結(jié)試驗（LLNA）是最為普遍使用的致敏性試驗，但其試驗材料為試驗小鼠的淋巴結(jié)細胞，因此該系列方法被認為是對傳統(tǒng)動物試驗的優(yōu)化。在科學家的不斷努力下，已有很多過敏反應毒性機制的研究，2015 年新增的化學法和直接反應肽試驗就是基于過敏反應機制的方法，經(jīng)過多年驗證后發(fā)布的體外試驗方法。此外，LLNA：BrdU-Flow Cytometry的方法是對 LLNA：BrdU-ELISA 方法中發(fā)光物質(zhì) BrdU檢測手段的改進。人細胞系 h-CLAT 法、IL8 Luciferase法和 Myeloid U937 法，也都是基于過敏機制設計的體外方法。

3.4 皮膚光毒性

國際上普遍認可的皮膚光毒性體外試驗，僅 3T3 細胞中性紅攝取試驗一種（3T3 NRU）［28］。日本動物替代試驗研究中心還發(fā)布了 2 個試驗方法：活性氧試驗（ROS）和酵母紅細胞試驗（Yeast-RBC），但目前沒有其他國家和地區(qū)驗證或發(fā)布這兩種方法。

表 1 化妝品相關替代方法的驗證進展

3.5 皮膚吸收試驗

我國的化妝品安全技術規(guī)范中并沒有這類試驗，但皮膚吸收率是化妝品風險評估中評價暴露量的重要參數(shù)之一，對化妝品原料或配方的安全性評價都有重要意義。無論是體外還是體內(nèi)的試驗都是通過檢測放射性同位素的滲透量來評估被測物質(zhì)的吸收量，體外試驗采取離體的人或動物的皮膚來進行［29］。

3.6 急性經(jīng)口毒性試驗

OECD 認可的方法有：固定劑量程序法（FDP）、上下程序法（UDP）、急性毒性分類法（ATC）以及 Balb/c 3T3 細胞法和 NHK 細胞法［30-32］。前 3 個方法雖仍需要使用實驗動物，但大大減少了實驗動物的使用量，而后 2 個試驗是基于細胞毒性的體外試驗方法。OECD 早在 2002 年就已刪除了傳統(tǒng)的以死亡為毒理學終點檢測 LD50的方法。在化妝品安全性評價中，急性經(jīng)口毒性試驗的結(jié)果主要作為化妝品原料毒性分級、標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其他毒理學試驗劑量的依據(jù)［3］。

3.7 遺傳毒性試驗

遺傳毒性試驗一般是用于評價化妝品原料及染發(fā)（不含涂染型暫時性產(chǎn)品，如可沖洗掉的染料）、育發(fā)、美乳、健美類化妝品產(chǎn)品的遺傳毒性的試驗［3］。遺傳毒性的替代試驗有 Ames 試驗（微生物試驗）、體外微核試驗（OECD TG487、490）［33-34］、彗星試驗（Comet Assay）。

4 我國體外替代方法的研究現(xiàn)狀及思考

4.1 相關標準和法規(guī)

雖然我國對于替代方法的研究起步較晚，但已有一些相關的國家標準出臺。2009 年底，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局參考 OECD 的《化學品測試方法指南》第四部分［11］，陸續(xù)發(fā)布了 12 個針對化學品和化妝品動物替代試驗及檢驗相關規(guī)范的國家標準、行業(yè)標準（中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準）［35-46］。2012 年 2 月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局對化妝品用化學原料體外 3T3 中性紅攝取光毒性試驗方法面向社會公開征求意見［47］。

2013 年 12 月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《關于調(diào)整化妝品注冊備案管理有關事宜的通告》（2013 年第10 號通告）［48］，明確國產(chǎn)非特殊用途化妝品“風險評估結(jié)果能夠充分確認產(chǎn)品安全性的，可免予產(chǎn)品的相關毒理學試驗”。2015 年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局起草了《化妝品安全風險評估指南》（征求意見稿），其中指出化妝品安全風險評估能有效地反映出化妝品的潛在風險，一定程度上可以替代終產(chǎn)品毒理學試驗［49］。

4.2 我國替代方法研究遇到的問題及挑戰(zhàn)

在化妝品安全性評價方面，國際上已認可的化妝品替代試驗方法很多，但替代試驗用于評價化妝品終產(chǎn)品的數(shù)據(jù)并不多。在我國，相對動物試驗，替代試驗存在原材料未規(guī)?；a(chǎn)，試驗材料成本高，必需的配套儀器未國產(chǎn)化，很難獲得等缺點。因此，替代試驗在我國推廣實施存在一定的困難。

如前所述的化妝品眼刺激替代試驗評價方法中，歐美國家普遍認可 BCOP，對我國很多地區(qū)甚至化妝品產(chǎn)地集中的廣東省、江浙滬地區(qū)來說，獲取大量新鮮的牛角膜有一定困難。又比如化妝品皮膚刺激（腐蝕）性評價的方法，國際上公認的人工三維皮膚模型可以節(jié)約試驗成本，但皮膚模型屬于生物材料，保質(zhì)期短，若使用 OECD 認可的模型，運輸周期長、運輸成本高，會造成測試結(jié)果的偏差，因此我國要想發(fā)展體外模型類的替代試驗，需要有自主研發(fā)的產(chǎn)品。

OECD 認可的替代方法很多針對的是“化學品”或“混合物”，可用于評價化妝品原料和配方的安全性。而目前我國采取的許可管理制度，主要是對化妝品終產(chǎn)品進行安全性評價，原料和終產(chǎn)品的安全性評價結(jié)果和方法存在差異。因此，對國際上已認可的動物替代方法，是否適合中國的需求，需要進一步的評估確認和驗證，不能只是簡單的方法轉(zhuǎn)移。

4.3 我國替代方法的前景和思考

替代試驗是毒理學評價技術的進步，替代試驗方法的研究是國際化妝品監(jiān)管趨勢所向。我國作為全球第二大經(jīng)濟體，在技術上應該有話語權(quán)，因此，我國應積極推動化妝品替代毒理學方法研究與驗證體系的建設，建立一套適應我國國情的化妝品動物體外試驗檢測標準，完善化妝品質(zhì)量監(jiān)管的技術支撐體系，以保障化妝品質(zhì)量安全，促進化妝品行業(yè)發(fā)展。

替代方法在開發(fā)研究、驗證（validation）或轉(zhuǎn)移確認（verification）時，應充分考慮方法的可操作性、在中國的適用性及方法本身的使用條件等因素。很多國際上已驗證過的方法，如 OECD 的化學品指南，針對的是“化學品”或“混合物”。中國化妝品中，有一些植物提取物或根據(jù)中藥配方改良的產(chǎn)品，是否包含在 OECD 方法描述的“混合物”范圍內(nèi)，有待進一步的考證。另外，在選擇替代試驗進行檢測時，也要考慮到化妝品產(chǎn)品的形狀和顏色的影響，有些細胞毒性的方法，不適合檢測膏霜狀物質(zhì)或難溶的粉狀樣品，有些利用 MTT 染色或通過吸光度值來計算毒性結(jié)果的替代方法，被測化妝品的顏色和形狀也可能影響結(jié)果。

5 小結(jié)

綜上所述，雖然成熟的替代方法還有待于進一步研究和驗證，但是其發(fā)展方向毋庸置疑。對我國來說，替代方法的研究、驗證、轉(zhuǎn)移確認、法規(guī)認可非常迫切，應盡快建立起一套新的適應國際要求的標準體系。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.016

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所

王鋼力，Email：wanggl@nifdc.org.cn

2016-07-19