余福恒，李仲娟，，陳敏，蔡小康，廖進齊，譚婭玲 (.黃石市東方社區(qū)服務中心，湖北黃石435000；.湖北理工學院醫(yī)學院，湖北黃石435003)

·論著·

氧化石墨烯衍生物對L6細胞活性的影響

余福恒1，李仲娟1，2，陳敏2，蔡小康2，廖進齊2，譚婭玲2(1.黃石市東方社區(qū)服務中心，湖北黃石435000；
2.湖北理工學院醫(yī)學院，湖北黃石435003)

目的研究氧化石墨烯(GO)衍生物對L6細胞活性的影響。方法原代的L6細胞經(jīng)過1 d或3 d培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)并采取電子圖片保存；收集對數(shù)期成熟的L6細胞，MTT法測定細胞增殖活性；對數(shù)期成熟的L6細胞，經(jīng)GO衍生物3 d的刺激培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法測定腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)。結果原代L6經(jīng)過3 d培養(yǎng)，80%以上細胞分化為成熟的L6細胞；0.3μg/m LGO衍生物(GO-L和GO-D)經(jīng)過3 d刺激，GO-L刺激細胞增殖的OD值為(0.52±0.28)，GO-D刺激細胞增殖的OD值為(0.81± 0.34)，兩者與對照細胞OD值(0.18±0.06)比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=6.05，P＜0.01)；其中D型衍生物對L6細胞增殖活性強于L型衍生物，兩者之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4.54，P＜0.05)；L型衍生物和D型衍生物均能誘導L6細胞分泌TNF-α[(18.6±5.36)vs(24.9±8.86)]和少量IFN-γ[(14.3±3.78)vs(13.8±2.62)]。但IFN-γ分泌兩者差異無統(tǒng)計學意義(F=0.82，P＞0.05)。結論GO衍生物能誘導L6細胞活化和分泌TNF-α，可能會影響L6細胞中糖的代謝與調節(jié)。

氧化石墨烯；細胞增殖；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的單原子層結構以及其相對較大的表面積使其成為藥物載體的較佳選擇[1]。它不僅可以吸附芳香類藥物也可以負載疏水性藥物，這對于難溶于水的藥物劑型的設計具有重大的意義[2]。最近，GO在聚乙二醇的修飾后作為靶向藥物應用在不同類型細胞，Liu等[3]就曾用修飾后的GO作為抗癌藥物的載體進行抗直腸癌細胞。王潔等[4]綜合考察了GO對大鼠的干細胞活性。Yang等[5]研制出了多重靶向的GO阿霉素藥物體系，用于抗乳腺癌細胞。作為新型的醫(yī)藥納米材料GO對腫瘤細胞的研究較多，但GO衍生物的對正常細胞活性的評價并沒有很多的報道，本實驗通過石墨烯衍生物(L型衍生物GO-L和D型衍生物GO-D)對L6肌肉細胞生長成熟狀況、細胞增殖活性和細胞因子的分泌三方面綜合考察，探討石墨烯衍生物對L6肌肉細胞分化成熟過程中的影響，為將來石墨烯衍生物在腎病糖尿病等疾病的診斷和治療中的應用提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥手性修飾的GO衍生物由武漢理工大學分子材料實驗室友情提供。小鼠原代L6細胞均購自武漢細胞保存中心，臺盼藍、BSS液、小牛血清和DMEM-F12培養(yǎng)液購自GIBCO公司，實驗室自行配制使用。胰蛋白酶、MTT購自上海博谷生物科技有限公司。培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板和細胞培養(yǎng)用的吸頭購自美國Costar公司。二甲基亞砜購自Sigma公司。

1.2 儀器湖南湘儀臺式高速冷凍離心機，蘇州凈化二級生物安全柜BHC-1300IIB2，上海三申醫(yī)療壓力蒸汽滅菌器，美國ThermoFisher賀利氏CO2培養(yǎng)箱，美國伯樂DNM-9602型酶標儀，日本OLYMPUS CKX41倒置生物顯微鏡及OLYMPUS 1X74倒置熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 L6細胞的培養(yǎng)[6]原代L6細胞按105個細胞/孔分別加入6孔板，用DMEM-F12培養(yǎng)液置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%胎牛血清和雙抗(100U/m L青霉素和100mg/m L硫酸鏈霉素)，細胞生長至整個瓶底面積的80%時進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測細胞活性[7]在96孔培養(yǎng)板中，分別加入0.3μg/m L濃度GO-L或GO-D液并按105個細胞/孔進行混合培養(yǎng)66 h后加20μLMTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150μL二甲基亞砜振蕩10m in， 490 nm處測吸光度(opticaldensity，OD)值。

1.3.3 細胞因子的測定TNF-α(或INF-γ)的檢測按說明書進行。取包被抗單克隆抗體于96孔酶標板，加入100μL細胞培養(yǎng)上清或已知濃度的標準抗體，37℃孵育50m in，洗3次。再加入100μL酶標抗抗體繼續(xù)孵育1 h，洗滌后加入等量底物液，室溫孵避光15m in，加入終止液。450 nm測定光密度值，繪制標準曲線，計算樣本細胞因子水平。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。不同手性GO組與對照組的差異或不同手性GO組之間的差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 L6細胞生長的觀察圖1是L6細胞的原代細胞與成熟L6細胞的生長狀況對比，從圖片可以看出，原代L6細胞大多呈梭形或不規(guī)則多邊形，緊貼于培養(yǎng)瓶底部發(fā)生延性生長，培養(yǎng)3 d后，成熟L6細胞較原代細胞數(shù)量有所增加，沒有成團生長的細胞且達到培養(yǎng)瓶底部平面的80%以上，單個L6細胞可以邊界清晰以梭形為主，立體感強，細胞核小且細胞內出現(xiàn)肌性結構。

圖1 L6細胞的生長對比

2.2 GO衍生物對L6細胞活性的影響圖2所示，0.3μg/m LGO衍生物能促進L6細胞增殖，GO-L增殖活性[n=20，OD=(0.52±0.28)]低于GO-D[n=20，OD= (0.81±0.34)]，兩者差異有統(tǒng)計學意義(F=4.54，P＜0.05)。GO-L和GO-D增殖活性與對照組[n=20，OD=(0.18±0.06)]比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(F= 6.05，P＜0.01)。

2.3 GO衍生物對L6肌肉細胞釋放細胞因子的影響圖3A顯示(n=20)，GO衍生物能誘導L6肌肉細胞釋放TNF-α，其中D型衍生物TNF-α的表達水平(24.9±8.86)強于L型衍生物TNF-α的表達水平(18.6±5.36)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(F=4.82，P＜0.05)。圖3B(n=20)顯示，GO衍生物能誘導L6肌肉細胞分泌少量IFN-γ，L型衍生物IFN-γ(14.3±3.78)和D型衍生物IFN-γ的表達水平(13.8±2.62)差異無統(tǒng)計學意義(F=0.82，P＞0.05)，但對于對照組IFN-γ的表達水平(2.1±0.72)差異有統(tǒng)計學意義(F=5.64，P＜0.05)。

圖2 0.3μg/m L的GO衍生物對L6細胞生長活性的測定

圖3 0.3μg/m L的GO衍生物對L6細胞因子產(chǎn)生的影響

3 討論

GO衍生物是單原子結構，因其表面積大，很早就被作為藥物載體開發(fā)[8]。楊永崗等[9]通過GO的細胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，GO濃度降至100μg/m L時，對細胞毒性較低，40μg/m L濃度的GO對細胞僅有少許毒性，且細胞具有可逆性的恢復。本實驗所用的GO濃度為0.3μg/m L，結果顯示，GO衍生物對于原代L6肌肉細胞的增殖成熟有積極作用，GO衍生物(GO-L和GO-D)能促進成熟的L6肌肉細胞增殖活性，并且L型GO要弱于D型的作用。這可能與細胞在貼壁生長時，GO衍生物充當了其支撐物的空間結構有關。

近年來的研究證明骨骼肌具有分泌細胞因子的功能[10]，其中TNF-α、IL-18和IL-6在參與骨骼肌能源物質代謝、修復與合成的調控作用[11]。本實驗結果顯示，GO烯衍生物能誘導成熟的L6肌肉細胞分泌TNF-α和少量IFN-γ，D型衍生物對L6肌肉細胞釋放TNF-α作用較強。由于L6肌肉細胞被廣泛應用于糖尿病中胰島素抵抗細胞模型機理的研究[12-14]，因此，TNF-α的釋放可能與L6肌肉細胞糖代謝相關[15]。

IFN-γ在肌肉細胞中的作用尚未見報道，本次實驗也沒有對L6肌肉細胞中調控IFN-γ的蛋白作進一步研究，因此，L6肌肉細胞分泌少量IFN-γ的作用也不清楚。今后，將會對細胞因子相關蛋白的信號途徑作深入研究，從而揭示GO衍生物在疾病研究中的新應用。

[1]李松,顏紅俠,張夢萌,等.石墨烯的功能化及其在聚合物改性中的應用研究[J].材料開發(fā)與應用,2013,28(6)∶86-92.

[2]沈賀,張立明,張智軍.石墨烯在生物醫(yī)學領域的應用[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2011,30(1)∶218-223.

[3]Liu Z,Robinson JT,Sun X,etal.PEGylated nanographene oxide for delivery ofwater-insoluble cancer drugs[J].Journalof the American Chem ical Society,2008,130(33)∶10876-10877.

[4]王潔,劉加強,房兵,等.氧化石墨烯對大鼠骨髓間充質干細胞生物活性的影響[J].組織工程與重建外科雜志,2013,9(6)∶306-310.

[5]Yang X,Zhang X,Ma Y,et al.Superparamagnetic graphene oxide-Fe3O4nanoparticles hybrid for controlled targeted drug carriers [J].JournalofMaterialsChemistry,2009,19(18)∶2710-2712.

[6]楊景霏,廖進齊,陳敏,等.手性修飾氧化石墨衍生物對小鼠成神經(jīng)瘤細胞活性的影響[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2015,12(2)∶153-154.

[7]王世召,田野,江榮才,等.多胺類似物DENSPM對人膠質瘤LN229細胞增殖的抑制作用[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2013,12(2)∶101-105.

[8]Sun X,Liu Z,Welsher K,et al.Nano-graphene oxide of cellular imaging and drug delivery[J].Nano Res,2008,1(3)∶203-212.

[9]楊永崗,陳成猛,溫月芳,等.GO及其與聚合物的復合[J].新型炭材料,2008,23(3)∶193-200.

[10]賀強,漆正堂,丁樹哲.骨骼肌的內分泌功能與運動代謝適應[J].中國運動醫(yī)學雜志,2015,34(2)∶201-205.

[11]Plomgaard P,Penkowa M,Pedersen BK.Fiber type specific expression of TNF-alpha、IL-6 and IL-18 in human skeletalmuscles[J]. ExercImmunolRev,2005,15(11)∶53-63.

[12]王麗靜,張尉,劉小鶯,等.地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立[J].福建醫(yī)科大學學報,2007,41(3)∶282-284.

[13]張召鋒,趙明,王軍波,等.腫瘤壞死因子-α誘導大鼠L6細胞胰島素抵抗模型的建立[J].衛(wèi)生研究,2010,39(2)∶149-151.

[14]張召鋒,丁葉,戴小倩,等.地塞米松誘導L6肌細胞胰島素抵抗模型的建立及EGCG的保護作用研究[J].中國預防醫(yī)學雜志,2009, 10(12)∶1041-1043.

[15]Keller C,Keller P,GiraltM,et al.Exercise normalises overt-expression of TNF-alpha in knockoutm ice[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,321(1)∶179-182.

Effect of graphene oxide derivatives on the activity of L6 cells.

YU Fu-heng1,LIZhong-juan1,2,CHEN Min2,CAI Xiao-kang2,LIAO Jin-qi2,TAN Ya-Ling2.1.Huangshi Oriental Community Service Center,Huangshi 435000,Hubei, CHINA;2.SchoolofMedicine,HubeiPolytechnic University,Huangshi435003,Hubei,CHINA

Objective To investigate the effectof graphene oxide(GO)derivatives on the activity of L6 cells. M ethods Morphologies of primary L6 cells,which had been cultured for 1 day or 3 days,and the cellmorphology were observed w ith inverted fluorescentmicroscope and saved as electronic graphics.Mature L6 cells in logarithmic phasewere collected.Cellproliferation activity was detected by MTT assay.Mature L6 cells in logarithm ic phase stimulated w ith GO derivatives had been cultured for 3 days,then cell culture supernatantswere collected.The serum tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interferon gamma(INF-γ)levelswere determined by ELISA.Results Over 80% of primary L6 cells had been cultured for 3 days differentiated into mature ones.0.3μg/m L GO derivatives(GO-L and GO-D)were stimulated by 3 d.OD value for cell proliferation stimulated by GO-L and GO-D was(0.52±0.28),(0.81±0.34),respectively.Both had significant differences compared w ith OD value for control cells[(0.18±0.06),F= 6.05,P＜0.01].Activity of GO-D on L6 cells proliferation was significantly higher than GO-L(F=4.54,P＜0.05).Both GO-L and GO-D could induce L6 cells to secrete TNF-α[(18.6±5.36)and(24.9±8.86)respectively]and a smallamount of IFN-γ[(13.8±2.62)and(14.3±3.78)respectively].But therewere no significant differences in IFN-γbetween the GO-L and GO-D(F=0.82,P＞0.05).Conclusion GO derivatives can induce L6 cellactivation and secretion of TNF-α, both ofwhichmay affect themetabolism and regulation of sugar in L6 cells.

Graphene oxide derivatives;Cell proliferation;Tumor necrosis factor alpha(TNF-α);Interferon gamma(IFN-γ)

R730.3

A

1003—6350（2016）16—2583—03

2016-03-03)

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.16.002

湖北省科技項目(編號：2011Cdc116)；湖北省黃石市科技項目(編號：黃科農[2012]1號)；教育部留學生啟動資金(編號：46-2)

李仲娟。E-mail：1525677891@qq.com