劉海燕

（河南省周口市食品藥品檢驗所，河南周口466000）

反相高效液相色譜法測定炎熱清片中龍膽苦苷含量

劉海燕

（河南省周口市食品藥品檢驗所，河南周口466000）

目的建立炎熱清片中龍膽苦苷含量的反相高效液相色譜法。方法色譜柱采用Agilent Hc-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；流動相甲醇-0.4%磷酸（10∶90 60∶40，0 30 mim），梯度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫25℃。結(jié)果龍膽苦苷進樣量在0.220 8～1.647 0 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7）；平均回收率為97.19%，RSD為1.07%（n=6）。結(jié)論該方法簡便，可行、重現(xiàn)性好，可用于炎熱清片中龍膽苦苷的含量測定。

反相高效液相色譜法；炎熱清片；龍膽苦苷；含量測定

炎熱清片以黃芩為君藥，輔以玄參、龍膽、石膏、柴胡、梔子、知母、薄荷腦等組方，具有解表清里、清熱解毒功效。其為中藥抗生素，臨床用于呼吸道炎、支氣管炎、肺炎、急性扁桃體炎，也可用于泌尿系感染和腸道感染。龍膽是方中主藥，性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效［1］。在炎熱清片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［2］中，以龍膽的主要活性成分龍膽苦苷作為定性定量控制指標(biāo)。筆者參考文獻［3-12］，采用高效液相色譜（HPLC）法測定龍膽苦苷的含量，經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法操作簡便，專屬性強，重復(fù)性好，陰性對照無干擾，能有效地控制該制劑的質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

SHIMADZULC-10AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHIMADZUSPD-10AVPUV～Vis檢測器，CKChrom色譜數(shù)據(jù)工作站；CPA-225D型電子分析天平；紫外分光光度計（法國西格瑪公司）；明澈TD24UV型電水系統(tǒng)；KQ-500型超聲波震蕩器；減壓干燥器。

1.2試藥

龍膽苦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110770-200712）；炎熱清片（西安大唐制藥集團有限公司，批號為0150701，0150915，規(guī)格為每片0.33 g）。甲醇為色譜純，超純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent Hc-C18柱（250 mm×4.6 mmm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（10∶90→60∶40，0→30 mim），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2溶液制備

對照品溶液：精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h的龍膽苦苷對照品5.54 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇-0.4%磷酸（1∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取炎熱清片10片，研細，混勻，精密稱取1.033 9 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇-0.4%磷酸（1∶1），稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再用甲醇-0.4%磷酸（1∶1）補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例及制備工藝，按供試品溶液的制備方法配制不含龍膽苦苷陰性對照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各10 μL，進樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計算為6 624。供試品溶液色譜圖中，龍膽苦苷峰與其他譜峰之間分離關(guān)系良好，峰形對稱，且陰性對照品溶液色譜在對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上無干擾。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取龍膽苦苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.110 8 g/L）2，5，7，10，12，15 μL，依法進樣，測定其峰面積，以峰面積積分值（Y）對進樣量（X）進行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=2 561 469.8X-35 726.4，r=0.999 7（n=6）。結(jié)果表明，龍膽苦苷進樣量在0.220 8～1.647 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果分別為4 602 081，4 584 362，4 554 735，4 597 261，4 566 374，4 580 543，RSD為0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別在0，2，5，7，10 h時取樣10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果樣品在不同時間測定的峰面積為2 785 085，2 737 842，2 778 547，2 749 741，2 761 236，RSD為0.63%（n= 5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為0150701）5份，分別為1.012 5，1.016 7，1.023 5，1.102 4。1.054 7 g，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果龍膽苦苷含量分別為每片0.774，0.792，0.794，0.769，0.782 mg，平均含量為每片0.782 mg，RSD為1.24%（n=5），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品6份（批號為0150701，質(zhì)量濃度為0.097 7 g/L），每份2 mL，各置10 mL容量瓶中，每份中分別加入對照溶液（質(zhì)量濃度為0.110 8 g/L）1.0，1.0，2.0，2.0，3.0，3.0 mL，加甲醇至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1　龍膽苦苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測定

取2個批號樣品，各2份，依法制備成供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL進樣，依法測定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算龍膽苦苷含量。結(jié)果批號為0150701的樣品中，龍膽苦苷的含量分別為每片0.780 1，0.781 2 mg，平均含量為每片0.782 2 mg；批號為0150915的樣品中，分別為每片0.786 5，0.784 8 mg，平均含量為每片0.785 6 mg。

3　討論

3.1檢測波長選擇

參照文獻［1］，取對照品溶液和供試品溶液用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果兩者均在270 nm波長處有最大吸收，且光譜圖一致，故選擇270 nm作為測定波長。

3.2提取溶劑選擇

［13-17］，分別以甲醇、50%甲醇、甲醇-0.4%磷酸（1∶1）作為超聲提取溶劑，根據(jù)龍膽苦苷結(jié)構(gòu)的特點，采用甲醇作為提取溶劑，在一定條件下龍膽苦苷可產(chǎn)生部分離子化現(xiàn)象或其結(jié)構(gòu)上的內(nèi)酯環(huán)產(chǎn)生部分開環(huán)現(xiàn)象，導(dǎo)致其色譜峰拖尾、開叉或裂分，影響測定結(jié)果，色譜峰的理論板數(shù)大多低于3 000。以甲醇-0.4%磷酸（1∶1）可使樣品溶解完全，其龍膽苦苷色譜峰無拖尾現(xiàn)象，峰形對稱，理論板數(shù)均大于5 000，且龍膽苦苷的提取率與甲醇超聲法提取的一致。故選擇甲醇-0.4%磷酸（1∶1）超聲30 min。

3.3提取溶劑用量篩選

曾考察甲醇-0.4%磷酸（1∶1）15，25，35 mL，結(jié)果表明，龍膽苦苷含量無明顯差異，提取溶劑量為15 mL時，過濾困難；提取溶劑量為25 mL，35 mL時，溶解完全且易過濾。故根據(jù)實際情況確定提取溶劑量為25 mL。

3.4提取時間篩選

曾考察超聲處理20，30，40 min，結(jié)果表明，提取時間為30 min和40 min的樣品龍膽苦苷含量已無明顯差異，因此確定提取時間為30 min。

3.5洗脫系統(tǒng)篩選

［9-14］，以甲醇-水為洗脫系統(tǒng)，在理論板數(shù)、分離度、峰形等方面不太好，但以甲醇-0.4%磷酸（10∶90→60∶40，0→30 mim）梯度洗脫，測定龍膽苦苷含量，在理論板數(shù)、分離度、峰形及出峰時間等方面均達到滿意的結(jié)果。

綜上所述，本研究中采用高效液相色譜法，選用龍膽苦苷作為指標(biāo)性成分，對炎熱清片中的龍膽成分進行測定。本法簡便易行，重復(fù)性好，回收率高，準(zhǔn)確度高，能有效控制該藥的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：96.

［2］YBZ13632005-2012-1，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）［S］.

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Content Determination of Gentiopicroside in Yanreqing Tablets by RP-HPLC

Liu Haiyan
（Zhoukou Food and Drug Inspection Institute，Zhoukou，Henan，China466000）

ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for the content determinate of gentiopicroside in Yanreqing Tablets.Methods The Agilent Hc-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）chromatography column was used，gradient elution was carried out with methanol-0.4% phosphoric acid（10∶90→60∶40，0→30 mim）as mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 270 nm，the column temperature was 25℃.ResultsThe calibration curve of gentiopicroside was in a good linearity in the range of 0.220 8-1.647 0 μg（r=0.999 7）.The average recovery rate was 97.19%，RSD was 1.07%（n=6）.ConclusionThe method is simple，feasible and reproducible，and it can be used in the content determination of gentiopicroside in Yanreqing Tablets.

HPLC；Yanreqing Tablets；gentiopicroside；content determination

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）15-0071-03

劉海燕（1974-），女，漢族，大學(xué)本科，副主任藥師，主要從事藥品檢驗工作，（電子信箱）13939418667@163.com。

（2016-02-18；

2016-04-15）