◎卞 璐，張 旭

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽(yáng)鐵路局錦州機(jī)務(wù)段，遼寧 錦州 121001）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

◎卞 璐1，張 旭2

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽(yáng)鐵路局錦州機(jī)務(wù)段，遼寧 錦州 121001）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速、高效擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)的等溫核酸擴(kuò)增方法，可在數(shù)十分鐘內(nèi)完成，通過(guò)使用鏈替換核酸聚合酶?；诖耍铜h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及其在食源性病原微生物的檢測(cè)和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方面做一綜述。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；食品；檢測(cè)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由日本榮研株式會(huì)的Notomi T.等首次報(bào)道的一種新的核酸擴(kuò)增方法，不僅能快速擴(kuò)增DNA，也可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的直接擴(kuò)增[1]。LAMP技術(shù)已經(jīng)在核酸研究、病原微生物的檢測(cè)、疾病的診斷和預(yù)防、動(dòng)物的早期胚胎性別鑒定等生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并取得了一些成就[2-6]。近年來(lái)，該技術(shù)也逐步被應(yīng)用到食品檢測(cè)中來(lái)。該文就LAMP技術(shù)的原理及其在食品檢測(cè)即食源性病原微生物的檢測(cè)和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方面做一綜述。

1　LAMP技術(shù)原理

雙鏈DNA在65 ℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物與雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)延伸的時(shí)候，另一條鏈就會(huì)脫落變成單鏈，LAMP方法就是利用DNA的這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)而成的。

1.1LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)

LAMP方法的4個(gè)引物是針對(duì)靶基因上的6個(gè)區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)的，這6個(gè)區(qū)域分別是位于3'端的F3c區(qū)段，F(xiàn)2c區(qū)段、F1c區(qū)段和位于5'端的B1區(qū)段、B2區(qū)段、B3區(qū)段（見(jiàn)圖1）。LAMP法的2條內(nèi)引物FIP（Forward Inner Primer）和BIP（Back Inner Primer），F(xiàn)IP包含有F1c序列、TTTT連接子和F2（F2c的互補(bǔ)序列）；BIP包含有B1c（B1的互補(bǔ)序列）、TTTT連接子和B2序列；2條外引物為F3（F3c的互補(bǔ)序列）和B3序列（B3c的互補(bǔ)序列）（見(jiàn)圖1）[7]。LAMP引物設(shè)計(jì)除了要避免引物二聚體形成、3′端發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物自身互補(bǔ)等原則外，對(duì)引物之間的距離也有要求，F(xiàn)3和F2之間，B2和B3之間的距離應(yīng)該是0～20 bp，引物中形成環(huán)的部分距離是40～60 bp，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的區(qū)域的距離建議是120～180 bp[8]。

圖1　靶序列上6個(gè)特異區(qū)及引物設(shè)計(jì)圖

1.2LAMP技術(shù)的操作程序

LAMP等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系通常為25 μ L，包含了模板DNA、引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。其中內(nèi)引物濃度為0.8～2.0 μ mol/L，外引物濃度為0.2～0.8 μ mol/L，鎂離子濃度為2～10 mmol/L。各種物質(zhì)混勻后，置于在60～65 ℃保溫60～90 min，80 ℃滅活10 min，產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)用肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度變化[9，10]。

2　LAMP技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，LAMP技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在食源性病原微生物的檢測(cè)和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)兩個(gè)方面[11-13]。

2.1食源性病原微生物的檢測(cè)

LAMP技術(shù)在食源性致病菌、食源性病毒[14]及食源性寄生蟲(chóng)[15]的檢測(cè)方面均有研究，但目前報(bào)道最多的是食源性致病菌的檢測(cè)。董鑫悅等以阪崎腸桿菌的OmpA序列為靶基因，建立了一種檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌的方法。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度為3.7×101cfu/mL，其靈敏度是PCR方法的10倍，人工污染阪崎腸桿菌滅菌乳的檢測(cè)限為4.3×101cfu/mL，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短的特點(diǎn)[16]。程曉艷等根據(jù)副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP快速檢測(cè)技術(shù)，其細(xì)菌DNA最低檢出限為35.5 fg/反應(yīng)管，并利用該方法對(duì)扇貝樣品中致病性副溶血弧菌進(jìn)行了檢測(cè)，證明LAMP技術(shù)可用于水產(chǎn)品致病菌的快速檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單、安全可靠[17]。

2.2食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)

自世界上首例轉(zhuǎn)基因煙草1983年在美國(guó)問(wèn)世以來(lái)[18]，轉(zhuǎn)基因作物的種類與日俱增，其中轉(zhuǎn)基因大豆占全球種植面積的51%，玉米占31%，棉花占13%，油菜占5%[19]。而隨著這些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大量流入市場(chǎng)，其安全性問(wèn)題已成為全球爭(zhēng)論的熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法操作步驟煩瑣、檢測(cè)成本高、時(shí)間長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和跟蹤檢測(cè)。LAMP技術(shù)作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)須PCR儀和昂貴的試劑、可快速高效擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，已逐步應(yīng)用于食品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)分析。我國(guó)近年來(lái)開(kāi)展了食品中轉(zhuǎn)基因成分的LAMP檢測(cè)方法的研究。吳少云等針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計(jì)4條特異性引物，建立的實(shí)時(shí)濁度法LAMP快速檢測(cè)技術(shù)，能夠特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系，其最低檢出限為0.01%，是普通PCR方法的10倍[20]。

總之，作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，LAMP技術(shù)既符合食品臨床檢驗(yàn)所需的要求，也存在著某些不足。隨著LAMP技術(shù)的不斷發(fā)展和改良，LAMP作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，必將會(huì)憑借其強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和食品檢測(cè)部門得到應(yīng)用和推廣。而該技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣，對(duì)于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全和推動(dòng)食品國(guó)際貿(mào)易發(fā)展無(wú)疑具有重要的意義。

[1] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al．Loopmediated isothermal amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

[2]陳伯祥，楊 明，常 亮，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物傳染病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（4）：90-96.

[3]李 鵬，馬艷嬌，于 劍，等．豬肺炎支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24（4）：480-483.

[4]向智龍，卓建華，鮮思美，等．羊口瘡病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（6）：588-592.

[5]高德臣.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）：219-221.

[6]肖海霞.應(yīng)用PCR法和LAMP法鑒定牛早期胚胎性別的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[7] Wang L，Shi L，Alam M J，et al. Special and rapid detection of foodborne Salmonella by loop-mediated isothermal amplification method[J]. Food Research International，2008，41（1）：69-74.

[8]張耀祺.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)食物中的單增李斯特菌[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[9]彭濤，朱欽昌，王玉濤，等.核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2009：5-12.

[10]Gunimaladevi I，Kono T，Lapatra S E，et al. A loop mediated isothermal amplification （LAMP）method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV）in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）[J]. Arch Virol，2005，150（5）：899-909.

[11]王華，王君瑋，徐天剛，等．非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增診斷方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（9）：940-944．

[12]趙彥宗，張顯浩，余小利，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（12）：53-56.

[13]鮮思美，韋洪才，尹強(qiáng)軍，等.鵝副黏病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012，27（11）：150-154.

[14]Parida M M，Santhosh S R，Dash P K，et al. Rapid and real-time detection of Chikungunya virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Journal of Clinical Microbiology，2007，45（2）：351-357.

[15]Fukuda S，Takao S，Kuwayama M，et al. Rapid detection of norovirus from fecal specimens by Realtime Reverse Transcription-loop-mediated Isothermal Amplification assay[J]. Journal of Clinical Microbiology，2006，44（4）：1376-1381.

[16]董鑫悅，滿朝新，盧 雁，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌[J].食品工業(yè)科技，2013，35（5）：318-320，357.

[17]程曉艷，劉慶慧，黃 倢.副溶血弧菌tdh基因LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（8）：156-162.

[18] Zambryski P，Joos H，Genetello C，et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneratmn capacity[J]. The EMBO Journal，1983，2（12）：2-143.

[19]王 永，蘭青闊，趙 新，等.轉(zhuǎn)基因作物外源轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（4）：1473-1477.

[20]吳少云，唐大運(yùn)，李 琳，等.LAMP實(shí)時(shí)濁度法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系[J].食品與機(jī)械，2012，28（5）：79-82.

Loop-mediated Isothermal Amplification Technololy and Its Application in Food Detection

Bian Lu1， Zhang Xu2
（1.Liaoning Agricultural Economy School， Jinzhou 121001， China；
2. Shenyang Railway Bureau Jinzhou， Jinzhou 121001， China）

Loop-mediated isothermal amplification technology is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with strong specificity， simple operation， fast and efficient amplification etc， which can complete in dozens of minutes by using Chain replacement DNA polymerase. In this paper， the principle of loop-mediated isothermal amplification technology and its application in detection of the food borne pathogenic microorganism and geneticallymodifiedingredients in food were reviewed.

Loop-mediated isothermal amplification； Food； Detection

Q817

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.06.014