王翔，胡家劭

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056）

CREB絲氨酸129位點(diǎn)磷酸化提高miR-132的水平

王翔，胡家劭

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056）

目的通過(guò)磷酸化的環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的激活，使表達(dá)記憶的相關(guān)蛋白獲得長(zhǎng)時(shí)記憶，探討CREB絲氨酸（Ser）129位點(diǎn)的磷酸化對(duì)微小RNA-132（miR-132）的影響。方法采用長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（LTP）電刺激，尾靜脈注射方法給予糖原合成酶激酶3β抑制劑SB216763，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)CREB的磷酸化水平，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-132的表達(dá)情況。結(jié)果高頻刺激CA3-CA1神經(jīng)環(huán)路可成功誘導(dǎo)LTP，使大鼠海馬的CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化水平和miR-132的表達(dá)明顯升高；SB216763可抑制糖原合成酶激酶3β的活性，從而抑制CREB Ser129的磷酸化，使LTP的斜率增幅明顯降低，CREB Ser129的磷酸化水平及miR-132的表達(dá)明顯降低。結(jié)論

CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化通過(guò)調(diào)節(jié)miR-132的表達(dá)促進(jìn)LTP形成，LTP形成過(guò)程中CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化可調(diào)節(jié)miR-132的表達(dá)，從而影響長(zhǎng)期記憶形成。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)；微RNAs；蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶；磷酸轉(zhuǎn)移酶類；糖原合成酶激酶3；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；電位測(cè)定法；記憶

學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制研究一直是熱點(diǎn)問(wèn)題，環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是一種選擇性結(jié)合CREs的核蛋白。CREB的磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸（Ser）133位點(diǎn)和Ser129位點(diǎn)，一般認(rèn)為，通過(guò)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）使Ser133位點(diǎn)磷酸化后可使CREB的磷酸化活性增強(qiáng)［1］，而通過(guò)糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）使Ser129位點(diǎn)磷酸化則可使CREB活性下降［2］。經(jīng)PKA磷酸化后，CREB的轉(zhuǎn)錄活性可增加10～20倍，CREB的激活可導(dǎo)致記憶相關(guān)蛋白表達(dá)增加，產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶［3］。

微小RNA是內(nèi)源性的非編碼RNA，主要作用于轉(zhuǎn)錄后的mRNA，抑制蛋白質(zhì)合成。微小RNA-132（microRNA-132，miR-132）能夠通過(guò)促進(jìn)突觸后α-氨基-3羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體的合成，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶［4］。近年來(lái)已有文獻(xiàn)報(bào)道，CREB Ser133位點(diǎn)的磷酸化可以調(diào)節(jié)miR-132的水平［5-6］，但是有關(guān)CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化對(duì)miR-132的影響研究尚鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（long-term potentiation，LTP）造模，大鼠尾靜脈注射GSK-3β抑制劑，探討CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化能否調(diào)節(jié)miR-132的表達(dá)，從而分析其對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組20只雄性SD大鼠購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，周齡（7.0±1.0）周，體質(zhì)量（250.0±20.0）g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于有良好光線和充足飲用水及食物的25℃房間，均按照神經(jīng)科學(xué)研究動(dòng)物使用規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將20只大鼠分為對(duì)照組（Con組）和實(shí)驗(yàn)組（LTP組），每組10只。

1.1.2儀器與試劑CREB及其phosphoS129（武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)：ab32515、ab47373），TRIZOL（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，批號(hào)：15596-026），TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：D6110A］，引物（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司），TAKARA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：DRR096A］，GSK-3β抑制劑SB216763（上海拓旸生物科技有限公司，批號(hào)：L001075）。

1.2方法

1.2.1電刺激方法Con組大鼠給予腦內(nèi)海馬區(qū)一般性刺激；LTP組大鼠給予高頻刺激（high frequency stimulates，HFS），具體方法如下：大鼠腹腔給予烏拉坦（氨基甲酸乙酯，6 mL/kg）麻醉，采用電刺激方法激活CA3～CA1環(huán)路，根據(jù)所查文獻(xiàn)確定并記錄CA3～CA1通路的LTP情況。通過(guò)大鼠腦立體定位圖譜確定其腦內(nèi)海馬區(qū)CA3坐標(biāo)（前囟后3.5 mm，旁開(kāi)4.0 mm，深3.8 mm）和CA1坐標(biāo)（前囟后4.1 mm，旁開(kāi)2.4 mm，深2.8 mm）。將記錄電極放在CA1區(qū)，刺激電極放在CA3區(qū)，記錄到穩(wěn)定的波形后，以5～30 mV給予不同大小的刺激幅度，誘導(dǎo)出最大興奮性突觸后電位，選擇最大值的30%作為基礎(chǔ)刺激強(qiáng)度。在靜息狀態(tài)下給予60次刺激，每次間隔30s；然后給予10次強(qiáng)直刺激，每次刺激50次，間隔2 s；再以靜息狀態(tài)下的刺激強(qiáng)度刺激，每次間隔30 s，240次，記錄2 h。根據(jù)所得波形，按照該模式統(tǒng)計(jì)LTP的增幅和斜率變化，比較靜息狀態(tài)和強(qiáng)直刺激后比值評(píng)估LTP強(qiáng)度。

1.2.2miR-132檢測(cè)

1.2.2.1總RNA提取取兩組大鼠海馬組織，用液氮冷凍再研磨至細(xì)粉或用勻漿器勻漿，最后加入1mLTrizol，反復(fù)震蕩5 min；室溫下靜置10 min。每毫升Trizol中加入氯仿200 μL，蓋上蓋子，劇烈震蕩約1 min；室溫靜置2～5 min，然后10 000 r/min冷凍離心1 min，最上層即為含有RNA的樣品，通過(guò)電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取1 μg總RNA，按照試劑盒相應(yīng)步驟及試劑，37℃、15min，85℃、5 s，最后室溫冷卻檢測(cè)RNA濃度，-20℃保存。1.2.2.3miR-132檢測(cè)使用TAKARA PCR試劑盒檢測(cè)miR-132水平，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。引物：正義引物為5′-CTAGCCCCGCAGACACTAGC，反義引物為5′-CCCCGCCTCCTCTTGCTCTGTA。通過(guò)比較正反義引物的△△Ct計(jì)算miR-132豐度，由于U6 snRNA能在真核生物穩(wěn)定表達(dá)，故使用U6 snRNA作為對(duì)照。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)大鼠LTP后直接處死，分離海馬，使用組織勻漿液勻漿（氯化鈉50 mmol/L、三羥甲基氨基甲烷10 mmol/L、二水乙二胺四乙酸二鈉1 mmol/L、十二水釩酸鈉0.5 mmol/L、氟化鈉50 mmol/L、二苯甲烷1 mmol/L、苯基-甲基磺酰氟1 mmol/L），勻漿好的樣品再加入4×緩沖液（含8%十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷200 mmol/L、40%甘油），然后沸水中煮10 min，10 000 r/min、4℃離心10 min，去上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)待測(cè)樣品蛋白濃度，取相同上樣量在10%濃縮膠和4%分離膠中電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在6%牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液中封閉30 min后按照適當(dāng)?shù)目贵w稀釋比例孵育，加入二抗并進(jìn)行顯色。

1.2.4尾靜脈注射將SD大鼠固定在自制礦泉水瓶中，尾巴從瓶子后方的小孔暴露出來(lái)，使用75%乙醇消毒處理后，用頭皮針將SB216763（0.2 mg/kg）經(jīng)尾靜脈注射入大鼠血液中，從而抑制大鼠腦內(nèi)GSK-3β的活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CREB Ser129磷酸化及miR-132參與LTP形成HFS誘導(dǎo)LTP后大鼠海馬CDEB Ser129位點(diǎn)的磷酸化和miR-132的表達(dá)見(jiàn)圖1。

2.1.1HFS后兩組大鼠動(dòng)作電位增幅和相對(duì)總量表達(dá)強(qiáng)直刺激激活CA3～CA1環(huán)路后，LTP組大鼠海馬動(dòng)作電位無(wú)論是斜率和增幅均較強(qiáng)直刺激前明顯增加，而且均高于Con組（圖1A、C）；與對(duì)照組比較，LTP組動(dòng)作電位增加（1.70±0.13）倍（圖1B），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明LTP誘導(dǎo)成功。

圖1　HFS誘導(dǎo)LTP后大鼠海馬CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化和miR-132的表達(dá)

2.1.2蛋白質(zhì)印跡法和RT-PCR檢測(cè)CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化及miR-132的表達(dá)HFS后，LTP組大鼠CREB在Ser129位點(diǎn)的磷酸化及海馬miR-132的表達(dá)水平均明顯增加，分別較Con組增加（1.80±0.08）倍和（3.60±0.27）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1D、E、F。

2.2尾靜脈注射SB216763抑制miR-132表達(dá)LTP電刺激前給予大鼠尾靜脈注射SB216763后，通過(guò)HFS發(fā)現(xiàn)LTP受抑制，與Con組比較，LTP組動(dòng)作電位顯著降低，海馬miR-132的表達(dá)和CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化水平明顯降低，分別是Con組的（0.54±0.04）倍和（0.10±0.02）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2　應(yīng)用SB216763后大鼠海馬CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化和miR-132的表達(dá)

3　討論

miRNA與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系已有大量文獻(xiàn)報(bào)道。miRNA可調(diào)節(jié)LTP相關(guān)蛋白合成，包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）和AMPA［7］。同樣，在體外介導(dǎo)LTP也可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)［8-9］。研究表明，使用麻醉大鼠在海馬齒狀回區(qū)（dentate gyrus，DG）誘導(dǎo)LTP可以導(dǎo)致miR-132、miR-212表達(dá)上調(diào)和miR-219a表達(dá)下調(diào)，而NMDA的活性可以抑制這些miRNA的表達(dá)，AMPA的活性可以上調(diào)這些miRNA的表達(dá)［10］。但有研究發(fā)現(xiàn)，在清醒大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)LTP可以下調(diào)miRNA的表達(dá)，包括miR-132［9］。也有報(bào)道指出，在清醒大鼠體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的miRNA有很大改變，包括miR-132［11］。

本研究結(jié)果顯示，給予麻醉大鼠LTP電刺激后，海馬CA1區(qū)的miR-132水平明顯升高，而使用GSK-3β抑制劑SB216763后，CA1區(qū)的miR-132顯著降低。表明海馬CA1區(qū)miR-132的升高可以通過(guò)CREB Ser129的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)。

綜上所述，CREB Ser129的磷酸化是由GSK-3β介導(dǎo)的，而GSK-3β對(duì)學(xué)習(xí)記憶的鞏固和提高有非常重要的作用［12］，表明CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化對(duì)于記憶的鞏固和提取有重要作用。然而有報(bào)道指出，CREB Ser129位點(diǎn)的磷酸化可以降低CREB的活性，該位點(diǎn)的磷酸化所導(dǎo)致CREB活性降低在學(xué)習(xí)記憶中的作用還不清楚［13］。因此，CREB Ser129位點(diǎn)對(duì)于學(xué)習(xí)記憶的作用還有待進(jìn)一步探討。

［1］Suzuki A，F(xiàn)ukushima H，Mukawa T，et al.Upregulation of CREB-mediated transcription enhances both short-and long-term memory［J］.J Neurosci，2011，31（24）：8786-8802.

［2］Horike N，Sakoda H，Kushiyama A，et al.AMP-activated protein kinase activation increases phosphorylation of glycogen synthase kinase 3beta and thereby reduces cAMP-responsive element transcriptional activity and phosphoenolpyruvate carboxykinase C gene expression in the liver［J］. J Biol Chem，2008，283（49）：33902-33910.

［3］Tully T，Bourtchouladze R，Scott R，et al.Targeting the CREB pathway for memory enhancers［J］.Nat Rev Drug Discov，2003，2（4）：267-277.

［4］Phillpotts RJ，Tyrrell DA.Rhinovirus colds［J］.Br Med Bull，1985，41（4）：386-390.

［5］GuoJ，WangH，WangQ，etal.Expressionofp-CREBandactivity-dependent miR-132in temporallobeepilepsy［J］.IntJ Clin Exp Med，2014，7（5）：1297-1306.

［6］Nudelman AS，Dirocco DP，Lambert TJ，et al.Neuronal activity rapidly induces transcription of the CREB-Regulated MicroRNA-132，in vivo［J］. Hippocampus，2010，20（4）：492-498.

［7］OldeLoohuis NF，Ba W，Stoerchel PH，et al.MicroRNA-137 controls AMPA-receptor-mediated transmission and mGluR-dependent LTD［J］. Cell Rep，2015，11（12）：1876-1884.

［8］Park CS，Tang SJ.Regulation of microRNA expression by induction of bidirectional synaptic plasticity［J］.J Mol Neurosci，2009，38（1）：50-56.

［9］JoilinG，GuévremontD，RyanB，etal.RapidregulationofmicroRNAfollowing induction of long-term potentiation in vivo［J］.Front Mol Neurosci，2014，7：98.

［10］Wibrand K，Panja D，Tiron A，et al.Differential regulation of mature and precursor microRNA expression by NMDA and metabotropic glutamate receptor activation during LTP in the adult dentate gyrus in vivo［J］.Eur J Neurosci，2010，31（4）：636-645.

［11］Pai B，Siripornmongcolchai T，Berentsen B，et al.NMDA receptordependent regulation of miRNA expression andassociationwith Argonaute during LTP in vivo［J］.Front Cell Neurosci，2014，7：285.

［12］Hong JG，Kim DH，Lee CH，et al.GSK-3β activity in the hippocampus is required for memory retrieval［J］.Neurobiol Learn Mem，2012，98（2）：122-129.

Phosphorylation at serine 129 site of CREB for increasing miR-132 level

Wang Xiang，Hu Jiashao
（Medical School，Jianghan University，Wuhan，Hubei 430056，China）

ObjectiveTo investigate the influence of phosphorylation at serine（Ser）129 site of cAMP-response element binging（CREB）protein on micro RNA-132（miR-132）by activating phosphorylated CREB for the related protein expressing memory obtaining the long term memory.MethodsThe long-term potentiation（LTP）electric stimulation and tail vein injection were adopted to give glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）inhibitor SB216763，the level of CREB phosphorylation in rat hippocampus area was detected by using the Western blot and the miR-132 expression was detected by using RT-PCR.Results

High frequency stimulation at CA3-CA1 neurocircuit could successfully induce LTP，which significantly increased the expression level of phosphorylated CREB Ser 129 in rat hippocampus and miR-132 level；SB216763 could inhibit the GSK-3β activity，thereby inhibited serine 129 phosphorylation of CREB and significantly decreased the LTP slope amplification and reduced the CREB Ser phosphorylation level and miR-132 expression.ConclusionThe phosphorylation of CREB at the serine 129 site could promote the LTP formation by regulating miR-132 expression，the phosphorylation of CREB Ser 129 site regulates the miR-132 expression during the LTP formation process，thus influences the long term memory formation.

Cyclic AMP response element-binding protein；MicroRNAs；Protein-serine-threonine kinases；Phosphotransferases；Glycogen synthase kinase 3；Long-term potentiation；Potentiometry；Memory

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.010

A

1009-5519（2016）20-3125-03

王翔（1984-），博士研究生，主要從事神經(jīng)生物學(xué)、阿爾茨海默病的研究。

（2016-07-17）