程靜之　張藝能　周玉萍　黃小玲　田長恩

【摘 要】擬南芥AT3G13600編碼的IQM2含有1個IQ基序，是一個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白；其突變體表現(xiàn)為遲花表型，是研究鈣調(diào)素信號參與成花調(diào)控的新材料；其C-端與天花粉素同源，可能具有RNA結(jié)合活性。為了進(jìn)一步獲得IQM2參與成花調(diào)控的證據(jù)、研究植物體中與之結(jié)合的蛋白及其RNA結(jié)合活性，擬構(gòu)建P35S：HA-IQM2植物表達(dá)載體?？寺～@得IQM2 cds，利用SalI和SacI過渡到pMD19-SmaI-P35S-HA- SalI-SacI載體上，再利用SmaI和SacI將獲得的pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI載體定向克隆至表達(dá)載體pBIH1上，通過PCR和酶切鑒定，證明P35S-HA-IQM2表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

【關(guān)鍵詞】IQM2擬南芥；P35S：HA-IQM2；表達(dá)載體

鈣調(diào)素信號（Calmoduolin，CaM）是高等植物的一類非常重要的信號，參與多種細(xì)胞生理和生長發(fā)育調(diào)節(jié)。田長恩和周玉萍[1]對植物含IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）的類型及其功能特點等進(jìn)行了全面的綜述。擬南芥IQM家族有六個成員，即IQM1到IQM6，均只含有1個能與鈣調(diào)素結(jié)合的IQ基序（氨基酸序列為IQXXXRGXXXR），N-端與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（Pea Heavy-Mmetal Induced Protein 6A，PHMIP 6A）同源，C-端與天花粉素（Trichosantin）同源，可能具有RNA結(jié)合活性[2-3]。其中，IQM2由At3g13600編碼[2]。實驗證明，IQM2在植物和酵母細(xì)胞中都能與CaM5結(jié)合，因此是1個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白[4-5]。實驗室對IQM2進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并克隆得到其cDNA序列[6]，還發(fā)現(xiàn)其突變體在長日照條件下呈現(xiàn)遲花表型，暗示IQM2參與成花調(diào)控[3]，是研究鈣調(diào)素信號調(diào)控成花的新材料。本文構(gòu)建P35S：HA-IQM2表達(dá)載體，旨在進(jìn)一步獲得IQM2參與成花調(diào)控的證據(jù)、研究植物體中與之結(jié)合的蛋白及其RNA結(jié)合活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種和質(zhì)粒：農(nóng)桿菌菌株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葉德教授惠贈；質(zhì)粒T-Vector pMD19（Simple）購于TAKARA公司，pBIH1、pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8由本實驗室保藏。試劑盒和工具酶：質(zhì)粒提取、DNA純化、膠純化試劑盒和限制性核酸內(nèi)切酶均購自TAKARA公司?；瘜W(xué)試劑及其他：硫酸鏈霉素、氨芐青霉素鈉、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、蔗糖、酵母提取物等購自生工公司；MS（Murashige & Skoog）salts、潮霉素等購自Sigma公司。測序：由華大基因公司完成。引物合成：由TAKARA公司完成。

1.2 實驗方法

質(zhì)粒提取和DNA片段回收：按照相應(yīng)試劑盒提供的步驟進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)設(shè)置：按照鄭景生和呂蓓[7]提供的方法進(jìn)行。T-A克?。?.5μL目的片段+ 0.5μLT-Vector pMD19（Simple）+ 5μLSolution I，16℃連接過夜。大腸桿菌轉(zhuǎn)化：按黃永蓮和黃真池[8]提供的熱激轉(zhuǎn)化法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：采用菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并外送公司測序。

2 結(jié)果與分析

以pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8為模板，分別用SalI-IQM2-F和SacI-IQM2-R、SmaI-P35S-F和HA-R引物組合對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)PCR篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子pMD19- SalI-IQM2-SacI（圖1A，約1.8kb）和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI（圖1B，約0.85kb），送華大基因公司測序。

分別用SalI和SacI對測序證實無突變的載體pMD19-SalI-IQM2 cds-SacI和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI進(jìn)行雙酶切，后者得到具有相應(yīng)酶切位點的線性化載體，前者割膠回收約1.8kb的IQM2 cds，再將二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI。

分別用SmaI和SacI對中間載體pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2 cds-SacI和表達(dá)載體pBIH1進(jìn)行雙酶切，前者獲得約2.6kb的目的片段，后者獲得約14kb的線性化載體，分別大體系割膠回收，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子P35S：HA-IQM2。

將相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR和酶切鑒定（圖2）。在圖2中，A和B分別為P35S-HA和IQM2 cds的擴(kuò)增片段，得到約0.85kb和1.8kb的特異性條帶；C為質(zhì)粒SmaI和SacI雙酶切的結(jié)果，得到約14kb的載體片段和約2.6kb的P35S-HA-IQM2 cds目的片段。結(jié)果表明，P35S-HA-IQM2植物表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

3 討論

課題組發(fā)現(xiàn)IQM2含有1個IQ基序，是1個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白[2，4-5]；其突變體具有晚花表型，說明其涉及成花調(diào)控[3]；其C-端與天花粉素同源，可能具有RNA結(jié)合活性[2-3]。不過，與IQM2結(jié)合的鈣調(diào)素還不清楚；IQM2參與成花調(diào)控的證據(jù)還有待補充；其RNA結(jié)合活性尚未明確。因此，有必要構(gòu)建P35S：HA-IQM2表達(dá)載體。本研究成功構(gòu)建了該載體，在轉(zhuǎn)化IQM2突變體植株，篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合子植株后，可通過表型觀察，分析IQM2參與成花調(diào)控的功能；可利用HA標(biāo)簽釣取與IQM2結(jié)合的蛋白；還可利用RNA免疫共沉淀，分析IQM2的RNA結(jié)合與降解活性。

【參考文獻(xiàn)】

[1]田長恩，周玉萍.植物具IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報，2013，48：447-460.

[2]Zhou YP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J].Acta Physiol Plant，2010，32：191-198.

[3]張藝能.擬南芥IQM2參與開花調(diào)控的功能研究[D].廣州：廣州大學(xué)，2014.

[4]陳羽中.擬南芥IQM2基因功能的初步研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5]王龍濤.擬南芥IQM2基因功能的研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[6]陳羽中，周玉萍，蕙，桂林，郭培國，田長恩.擬南芥IQM2 cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析[J].武漢植物學(xué)研究，2010，28：353-358.

[7]鄭景生，呂蓓.PCR 技術(shù)及實用方法[J].分子植物育種，2003，1（3）：381-394.

[8]黃永蓮，黃真池.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的少量制備方法及轉(zhuǎn)化條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（11）：4450-4451.

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