吳亞文，張玉玲，李志紅，王玉梅，張 雯，王曉亮，張和平，張學軍，楊佳冰，李莉娟，趙 燕

（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預防控制中心，寧夏銀川　750011）

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灘羊胎兒彎曲桿菌的分離鑒定

吳亞文，張玉玲，李志紅，王玉梅，張 雯，王曉亮，張和平，張學軍，楊佳冰，李莉娟，趙 燕

（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預防控制中心，寧夏銀川750011）

［目的］ 對一規(guī)模化養(yǎng)殖場灘羊流產(chǎn)的原因進行確診，為流產(chǎn)羊的疫病診斷和防控提供建議。［方法］無菌采集流產(chǎn)胎兒血性腹水和流產(chǎn)母羊陰道分泌物進行細菌培養(yǎng)、分離和鑒定。［結(jié)果］ 分離到2株病原菌，經(jīng)形態(tài)特性、培養(yǎng)特性及生理生化特性觀察，鑒定為胎兒彎曲桿菌胎兒亞種；動物實驗表明，其對小白鼠有很強的致病性。［結(jié)論］ 致病性胎兒彎曲桿菌胎兒亞種是造成該羊場發(fā)生大面積流產(chǎn)的主要病原。

灘羊；胎兒彎曲桿菌；分離鑒定

胎兒彎曲桿菌胎兒亞種通常寄居于牛、羊、豬、鳥類和人的腸道中，有些菌株能從腸道經(jīng)血液進入內(nèi)臟，然后在胎盤繁殖，從而引起動物流產(chǎn)。胎兒彎曲桿菌為革蘭氏染色陰性，呈螺旋狀或“S”狀，在一些老齡培養(yǎng)物上可出現(xiàn)球狀或球桿狀，不形成芽胞和莢膜，在菌體的一端或兩端有鞭毛，呈快速螺旋狀穿梭運動。該亞種菌落小而圓，37 ℃培養(yǎng)48 h 直徑僅1～2 mm。菌體細胞較空腸及大腸彎曲桿菌大，末端較鈍，長短不一，短者僅及長者的一半，類似于弧菌。由該菌引起的母羊流產(chǎn)多發(fā)生于妊娠后3 個月，流產(chǎn)率可達25% 以上。母羊流產(chǎn)后，因胎衣不下引起子宮內(nèi)膜炎、長期不孕等而被淘汰，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟損失［1］。

2015年1月份，寧夏賀蘭縣某規(guī)?；驁龅? 200只待產(chǎn)灘羊（2014年7月購于內(nèi)蒙古臨河區(qū)）出現(xiàn)了個別灘羊流產(chǎn)的現(xiàn)象，有的發(fā)生在懷孕2～3月，有的發(fā)生在預產(chǎn)期前2～3天。截止到1月22日，有8只灘羊流產(chǎn)。最后，通過病原微生物的實驗室診斷，確定了此次灘羊流產(chǎn)的主要病因。采取控制措施1個月后，灘羊流產(chǎn)狀況逐步好轉(zhuǎn)，病情基本得到控制。

1　材料

1.1病料

寧夏賀蘭縣某規(guī)?；驁霭l(fā)生流產(chǎn)的1只1歲灘羊和1只流產(chǎn)死亡的胎兒。

1.2實驗動物

昆明系小白鼠8只（體重為18～20 g/只），雌雄不限，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3主要儀器及試劑

厭氧培養(yǎng)罐、布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基（可用于彎曲桿菌的培養(yǎng)），購自青島海博生物技術(shù)有限公司。5% 兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生理生化鑒定用培養(yǎng)基，均按參考文獻［2-3］中的方法制備。試管、生理鹽水、革蘭氏染液等常規(guī)實驗室器材，均由寧夏動物疾病預防控制中心實驗室提供。

2　方法

2.1樣品采集

2.2.1流產(chǎn)胎兒血性腹水的采集。用無菌注射器抽取流產(chǎn)胎兒的血性腹水（圖1）。

圖1　采集流產(chǎn)胎兒血性腹水

2.2.2流產(chǎn)灘羊陰道分泌物的采集。用0.1%新潔爾滅清洗流產(chǎn)灘羊外陰部，將滅菌棉拭子緩慢插入流產(chǎn)灘羊陰道內(nèi)，轉(zhuǎn)動并停留1 min后取出，置于滅菌試管內(nèi)。

2.2病料涂片鏡檢

將采集到的流產(chǎn)羔羊血性腹水、流產(chǎn)灘羊陰道內(nèi)分泌物分別進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

2.3病原菌的分離及純化

將采集的樣品接種于布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基，37 ℃混合氣體（質(zhì)量百分比為3.5% O2、10% CO2、86.5% N2）培養(yǎng)，觀察細菌生長情況及菌落特征。48 h后，如果有菌落生長，挑取單個菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.4培養(yǎng)特性及生理生化特性鑒定

2.4.1培養(yǎng)特性觀察。挑取布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基上單個菌落進行1%甘氨酸生長試驗、3.5%氯化鈉生長試驗、1%膽汁生長試驗以及25 ℃、42 ℃等不同溫度的生長試驗［3］。將分離菌接種于培養(yǎng)基后，在微需氧條件下培養(yǎng)72 h，觀察并記錄結(jié)果。

2.4.2生理生化特性觀察。參照文獻［3］的方法進行過氧化氫酶、氧化酶試驗，硫化氫產(chǎn)生試驗和馬尿酸水解試驗。

2.4.3運動力檢查。將滅菌生理鹽水滴于載玻片上，挑取純培養(yǎng)的單個菌落，與生理鹽水混勻后加蓋玻片，在油鏡下觀察其運動性［4-5］。

2.5溶血性試驗

將胎兒彎曲桿菌接種于5%兔血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有溶血現(xiàn)象。

2.6動物感染試驗

將分離的2株菌，用滅菌生理鹽水稀釋，取菌液后比濁為1.32×108個/mL，按0.5 mL /只腹腔注射接種于4只健康小白鼠；同時用生理鹽水作對照，按0.5 mL /只腹腔注射接種于4只健康小白鼠。正常飼喂和飲水，記錄小白鼠的精神狀態(tài)、外觀體況、發(fā)病和死亡情況。連續(xù)觀察7 d，然后對死亡小白鼠進行剖檢觀察。無菌挑取其心臟、肝臟、脾臟、胃等臟器于布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，進行革蘭染色。將結(jié)果與初始細菌的生化信息進行比對，確定菌株的致病性。

3　結(jié)果與分析

3.1涂片鏡檢結(jié)果

病料及純培養(yǎng)物革蘭氏染色，涂片鏡檢，均可見“逗點”型、“S”型、“海鷗展翅”型和少數(shù)螺旋狀的無芽孢革蘭氏陰性桿菌。

3.2分離菌形態(tài)及生化特性

3.2.1分離菌的形態(tài)學特征。從流產(chǎn)胎兒的血性腹水、流產(chǎn)灘羊生殖道分泌物中分離到2株純細菌培養(yǎng)物。在5% 兔血液培養(yǎng)基培養(yǎng)上，菌落為圓形、光滑、半透明、周邊整齊，沒有溶血現(xiàn)象。用布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，可見分離菌在微需氧條件下25 ℃生長，42 ℃不生長。菌落特征為圓形、光滑、濕潤、半透明，邊緣整齊（圖2）。鏡檢觀察可見培養(yǎng)物為彎曲而細長的革蘭氏陰性桿菌，多呈“逗點”狀、“S”型和“海鷗展翅”狀（圖3）。

圖2　布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖3　胎兒彎曲桿菌革蘭氏染色油鏡下形態(tài)

3.2.2分離菌的生理生化特性。分離菌及從試驗動物回收到的細菌均表現(xiàn)出一致的生化特性。分離株過氧化氫酶、氧化酶試驗呈陽性；分離菌株在三糖鐵培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生硫化氫；在含有1% 甘氨酸、1%膽汁的巰基乙酸肉湯中生長良好與歐都·吾吐那生［6］的報道稍有差別；在3.5% NaCl中未生長；馬尿酸鈉水解試驗陰性；運動力檢查試驗，油鏡觀察見其呈螺旋式運動。

3.3分離菌致病性

在4只小白鼠的腹腔內(nèi)注入純培養(yǎng)物后，小白鼠背毛逆立、精神萎靡，第3天開始死亡。到第5天，共有3只小白鼠死亡，剖檢試驗組小鼠，均可見肝臟和脾臟腫大；從死亡小白鼠的心臟、肝臟、脾臟中均能分離到疑似純培養(yǎng)物，經(jīng)鑒定表明與接種的菌株具有相同的生理生化及培養(yǎng)特性。動物試驗表明，小白鼠的發(fā)病是由目標菌株引起的。對照組小白鼠未表現(xiàn)異常。

4　討論

綜合上述各項實驗室診斷結(jié)果，可以確定從流產(chǎn)胎兒腹水內(nèi)、流產(chǎn)灘羊陰道分泌物中分離到的細菌，其形態(tài)、培養(yǎng)特性、生物學特性及溶血性均符合胎兒彎曲桿菌胎兒亞種的培養(yǎng)及生化特性，因此可認為引起此次灘羊流產(chǎn)的病原菌為致病性胎兒彎曲桿菌胎兒亞種。

動物試驗結(jié)果表明分離株具有較強的致病性。腹腔注射能引起小白鼠死亡，且能從其心臟、肝臟、脾臟中回收到與其生物學特性一致的病原菌，完全符合科赫法則。

胎兒彎曲桿菌主要在分娩時通過流產(chǎn)物傳播。所以在產(chǎn)羔季節(jié)，養(yǎng)殖場應做好相關(guān)消毒工作。對流產(chǎn)灘羊進行隔離治療，切斷傳染源。流產(chǎn)后的灘羊應至少隔離飼養(yǎng)1個月后再混群［7］。病羊不允許出售，以免擴大傳染。及時清除流產(chǎn)胎兒和陰道分泌物，徹底消毒污染物，如糞便、墊草等。

［1］ 武寧，張志平. 羊胎兒弧菌病的診斷報告［J］. 畜牧與飼料科學，2012，33（8）：127-128.

［2］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法：GB/T 18653—2002［S］. 北京：中國標準出版社，2002.

［3］ 何曉青. 衛(wèi)生防疫細菌檢驗［M］. 南昌：新華出版社，1989.

［4］ 朱戰(zhàn)波，崔玉東，侯喜林，等. 奶牛流產(chǎn)胎兒彎曲菌的分離鑒定［J］. 中國獸醫(yī)雜志，2004（12）：28-30.

［5］ 謝奉瑜，魏革，王哲，等. 胎兒彎曲菌空腸亞種的分離與鑒定［J］. 黑龍江醫(yī)藥，1982（1）：16-17.

［6］ 歐都·吾吐那生，齊亞銀，李巖，等. 羊流產(chǎn)胎兒彎曲桿菌的分離鑒定及動物感染試驗［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（20）：94-95.

［7］ 田樹軍，趙秀英，王鵬飛. 母羊流產(chǎn)原因分析及防治措施［J］. 河北畜牧獸醫(yī)，2002，18（4）：32.

（責任編輯：朱迪國）

Isolation and Identifi cation of Campylobacter fetus from Tan Sheep

Wu Yawen，Zhang Yuling，Li Zhihong，Wang Yumei，Zhang Wen，Wang Xiaoliang，Zhang Heping，Zhang Xuejun，Yang Jiabing，Li Lijuan，Zhao Yan
（Ningxia Center for Animal Disease Control and Prevention，Yinchuan，Ningxia 750011）

［Objective］ To ascertain the cause of abortion in Tan sheep population so as to provide advice for diagnosis，prevention and control of Campylobacter fetus infection. ［Methods］ Samples from fetal bloody ascites and aborted ewes vaginal secretions were aseptically collected for bacterial culture，isolation and identifi cation of bacterial testing.［Results］ Two strains of pathogenic bacteria were isolated，which were determined as Campylobacter fetus subspecies fetus by observing the morphological characteristics，cultural characteristics and physiological and biochemical characteristics. The isolates had strong pathogenicity for mice. ［Conclusion］ The main pathogens leading to many Tan sheep aborted were the pathogenic Campylobacter fetus subspecies fetus.

Tan sheep；Campylobacter fetus；isolation and identifi cation

S858.26

B

1005-944X（2016）09-0085-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.026

寧夏回族自治區(qū)科技支撐項目（2013ZZN30）