陳 張，林 青，唐 鳳，胡 蓉，殷亞蘭，高 雁

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊　830054；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊　830091)

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烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌群落的映震分析

陳 張1,2，林 青2，唐 鳳2，胡 蓉2，殷亞蘭2，高 雁2

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊830091)

【目的】對(duì)烏魯木齊10號(hào)泉定期采樣，并監(jiān)測(cè)水體中細(xì)菌總DNA含量變化，結(jié)合水文地球化學(xué)數(shù)據(jù)，探究細(xì)菌群落與地震的關(guān)系?！痉椒ā坎捎每寺∽愚D(zhuǎn)化法，制作檢測(cè)10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量變化的絕對(duì)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行精確定量、定性地監(jiān)測(cè)烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量的變化?！窘Y(jié)果】烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Cp= -3.262 4 LgC+25.075，相關(guān)系數(shù)為r= 0.999 8；監(jiān)測(cè)期內(nèi)10號(hào)泉水體細(xì)菌群落密度與CO2呈顯著正相關(guān)，與HCO3-呈顯著負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量與地震的發(fā)生確實(shí)存在一定的響應(yīng)規(guī)律：泉水細(xì)菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后，且隨震級(jí)的增加其最大恢復(fù)值也隨之而遞增；此外，在地震發(fā)生后的5～17 d內(nèi)，泉水體細(xì)菌總DNA含量變化出現(xiàn)極大值；烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌群落與該泉水文地球化學(xué)因子HCO3-與CO2的含量變化關(guān)聯(lián)緊密，可作為后期重點(diǎn)觀(guān)測(cè)研究對(duì)象；10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量變化規(guī)律可作為地震預(yù)測(cè)的參考因素之一。

烏魯木齊10號(hào)泉；地震；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；細(xì)菌總DNA含量；水文地球化學(xué)

0　引 言

【研究意義】地震災(zāi)害是主要自然災(zāi)害之一，其孕育過(guò)程十分復(fù)雜，其形成機(jī)制也是多種多樣的。有研究表明地震來(lái)臨前，一些動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生異常反應(yīng)[1]，然而，基于斷裂帶上泉水中的微生物與地震的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。生物圈中的微生物占整個(gè)原核生物的6%～40%[2,3]，是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的主要生命力[4]，地震發(fā)生前，地球內(nèi)部流體由于板塊遷移會(huì)隨板塊裂縫排出，釋放出大量的地球化學(xué)物質(zhì)及元素，處于地震斷裂帶上泉水中的微生物群體會(huì)對(duì)其生存的環(huán)境做出靈敏地反應(yīng)[5]。研究選取的10號(hào)冷泉位于烏魯木齊南部柳樹(shù)溝-紅雁池?cái)嗔褞?，該泉常年水溫變化甚微，且流徑相?duì)封閉，幾乎不受外界干擾[6]，為此次實(shí)驗(yàn)研究水體細(xì)菌群落密度與水文地球化學(xué)和地震之間的關(guān)系提供理想條件?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，對(duì)于泉水中的微生物群落的變化與地震的響應(yīng)關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，且大多數(shù)集中于環(huán)境水體的微生物對(duì)于某些化學(xué)元素關(guān)系的研究，例如Mostafa S. Elshahed等[7]研究了含硫泉水中細(xì)菌群落的多樣性；J.P.Toutain 和Franck Poitrasson等[8]發(fā)現(xiàn)在一次里氏5.2的地震前后，泉水中的氯離子含量以及鉛濃度均發(fā)生突升驟降。國(guó)內(nèi)對(duì)于冷泉水的研究多集中于地下流體對(duì)于地震的響應(yīng)模式[9]，采用T-RFLP技術(shù)[10]檢測(cè)了10號(hào)泉水體細(xì)菌在時(shí)間尺度上的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)地球化學(xué)元素的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌類(lèi)群表現(xiàn)為隨機(jī)性動(dòng)態(tài)變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以上檢測(cè)手段耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法快速、精確檢測(cè)泉水中細(xì)菌群落的變化。實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、快速，能精確定性、定量樣本，為實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[11]，該技術(shù)常見(jiàn)于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等研究[12]，運(yùn)用于微生物的環(huán)境群落分析較為罕見(jiàn)。通過(guò)檢測(cè)泉水細(xì)菌群落密度，探究其與水文地球化學(xué)的關(guān)系，進(jìn)而分析10號(hào)泉水體細(xì)菌群落的映震特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用熒光定量PCR分子生物學(xué)技術(shù)，分析10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量變化與地震發(fā)生的相關(guān)性，探究該泉水中細(xì)菌群落與地震的響應(yīng)關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材 料

1.1.1儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：LightCyclerR480Ⅱ 羅氏公司。

1.1.2相關(guān)主要試劑

T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒 (Sangon)；SYBR Green I Master熒光染料試劑盒(Roche)。

1.1.3樣品采集

自2014年9月23日～2015年3月31日期間，每5 d從烏魯木齊10號(hào)泉站點(diǎn)采集泉水樣品。測(cè)定HS-、Ar、Rn、HCO3-、F-、CO2、N2、Hg、流量、室壓，共10項(xiàng)理化指標(biāo)。表1

1.2方 法

1.2.1檢測(cè)期內(nèi)地震發(fā)生情況

表1地震發(fā)生時(shí)刻記錄
Table 1 Records of earthquake occurrence

時(shí)間(北京時(shí)間)Time(BeiJing)震級(jí)Earthquakemagnitude緯度Latitude經(jīng)度Longitude深度Depth/km震源Seismiccentre2015/03/1811:13Ms343.8°N86.4°E11.5昌吉回族自治州呼圖壁縣2015/03/1307:41Ms343.8°N87.9°E10.0烏魯木齊市米東區(qū)2015/02/0116:06Ms3.243.9°N88.2°E2.0昌吉回族自治州阜康市2014/12/2816:46Ms344.3°N87.5°E2.9五家渠市2014/12/0200:10Ms2.943.3°N87.8°E2.4烏魯木齊市烏魯木齊縣2014/10/2011:57Ms4.543.9°N88.5°E4.3昌吉回族自治州阜康市

1.2.2泉水細(xì)菌總DNA的提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及樣本RT-qPCR檢測(cè)1.2.2.1 泉水細(xì)菌總DNA 的提取

泉水細(xì)菌總DNA的提取主要參照Shaheen等[13]的方法，稍作改動(dòng)。

1.2.2 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

隨機(jī)選取無(wú)震時(shí)期的樣品2015-1-1為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作材料，采用細(xì)菌通用引物338f (5’- ACTCCTACGGGAGGCAG -3’)和518r(5’- ATTACCGCGGCTGCTGG -3’)擴(kuò)增細(xì)菌保守區(qū)，將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，取其中10 μL測(cè)序；取10 μL進(jìn)行克隆子轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒試劑盒提取轉(zhuǎn)化克隆子的質(zhì)粒，并將其稀釋為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2.3樣本Real-Time PCR檢測(cè)

將泉水樣本進(jìn)行Real- Time PCR檢測(cè)，每個(gè)樣本做3組平行，Real- Time PCR檢測(cè)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，5min；擴(kuò)增步驟：變性94℃，20 s；退火60℃，45 s；延伸72℃，1 min；35個(gè)循環(huán)，在延伸步驟時(shí)收集熒光信號(hào)。溶解曲線(xiàn)溫度設(shè)置在65～95℃，每0.11℃讀數(shù)，其間停留5 s。最后反應(yīng)程序冷卻至40℃。Real-Time PCR檢測(cè)體系控制軟件采用LightCyclerR480Ⅱ Software release1.5.0 (Version1.5.0.39) 。

2　結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)序結(jié)果

經(jīng)篩選，確定將細(xì)菌16 S rDNA序列的A-6號(hào)克隆子作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其16 S rDNA片段序列長(zhǎng)度為180 bp。該序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中Sulfurospirillum barnesii SES-3( KM410847 ) 相似性為97% ，屬于10號(hào)泉的土著菌屬[14]，可用于實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。

測(cè)序結(jié)果為：-GGGGTCGTTCATGCGAGGT

AACTCTGATGTAGCACGCCGCGTGGAGGATGAC

ACATCTCGGTGCGTAAACTCCTTTTATTAGGGAAGATAATGACGGTACCTAATGAATAAGC

ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAGTCCGTG-

2. 2 Real-Time PCR 標(biāo)準(zhǔn)樣品與樣本測(cè)定結(jié)果及可信度

2.2.1Real-Time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

分別以10 倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品中DNA 模板濃度與Cp值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。為保證樣本定量有穩(wěn)定可重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)需滿(mǎn)足以下特點(diǎn)：一致的重復(fù)反應(yīng)、高的線(xiàn)性和高的擴(kuò)增效率及斜率[15]。該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擴(kuò)增效率E=2.038，r= 0.999 8，S= -3.262 4，且重復(fù)性好，說(shuō)明以此標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是合格的。圖1

圖1Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
Fig. 1 Real-Time PCR standard curve

2.2.2Real-Time PCR 溶解曲線(xiàn)

以10 倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR 過(guò)程中溶解溫度(84℃)的測(cè)定值做溶解曲線(xiàn)，結(jié)果表明，可見(jiàn)單一峰值且無(wú)雜峰，表明擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一致。圖2

圖2Real-time PCR 溶解曲線(xiàn)
Fig. 2 Real-time PCR melting curve

2.2.3Real-Time PCR 樣本檢測(cè)結(jié)果

樣本Real-Time PCR 擴(kuò)增曲線(xiàn)顯示，每一組樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)均勻而平滑，且每個(gè)平行樣本間所測(cè)的Cp值之差均在要求范圍之內(nèi)，表明樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)平行關(guān)系良好，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度較高[16]。試驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后樣品均到達(dá)平臺(tái)期，擴(kuò)增效果較好，在第15個(gè)循環(huán)時(shí)進(jìn)入熒光PCR指數(shù)擴(kuò)增階段，在此階段，PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)一般選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。圖3

圖3Real-time PCR 擴(kuò)增曲線(xiàn)
Fig.3 Real-time PCR amplification curve

2.310號(hào)泉水文地球化學(xué)變化趨勢(shì)

每日測(cè)定泉水10項(xiàng)理化性質(zhì)，測(cè)量數(shù)據(jù)導(dǎo)入基于GIS的地震分析預(yù)報(bào)系統(tǒng)(Mapsis 2.8.5)繪制理化參數(shù)波動(dòng)折線(xiàn)圖，結(jié)果表明，檢測(cè)期內(nèi)，HS-、N2、流量的變化出現(xiàn)了顯著高于其背景值的情況，但與地震發(fā)生時(shí)刻無(wú)響應(yīng)關(guān)系，其他指標(biāo)均在其背景值內(nèi)波動(dòng)。圖4

2.410號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量變化

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，系統(tǒng)自動(dòng)生成檢測(cè)結(jié)果，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2010中可得對(duì)應(yīng)細(xì)菌總DNA含量變化趨勢(shì)，可知該泉水細(xì)菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后的規(guī)律，只有2015年3月13日樣品震前低于震后；此外，2014年12月2日、2015年2月1日三次地震隨著震級(jí)依次遞增，DNA含量的極大值也隨之而依次遞增。且在地震發(fā)生后的5～17 d內(nèi)，泉水細(xì)菌總DNA含量變化出現(xiàn)極大值。圖5

圖4檢測(cè)期內(nèi)泉水10項(xiàng)水文地球化學(xué)變化
Fig.4 Hydrogen chemical changes in monitoring period of the No.10 spring

2. 5泉水細(xì)菌總DNA含量與水文地球化學(xué)的相關(guān)性

采用 SPSS19.0 對(duì)試驗(yàn)所得泉水細(xì)菌總DNA含量與10項(xiàng)水文地球化學(xué)結(jié)果做相關(guān)性分析，分析結(jié)果表明，泉水細(xì)菌總DNA含量與泉水中溶解CO2氣體存在顯著正相關(guān)性，而與HCO3-存在顯著負(fù)相關(guān)性，顯著相關(guān)性P< 0.05。表 2

注：圖中虛線(xiàn)處表示地震發(fā)生時(shí)刻

Note：The dotted tine in the figure represents the earthquake occurrence time

圖5檢測(cè)期內(nèi)10號(hào)泉水細(xì)菌總DNA含量變化
Fig.5 DNA concentration of bacteria changes in monitoring period of the No.10 spring
表 2泉水細(xì)菌總DNA含量與水文化學(xué)相關(guān)性
Table 2The correlation analysis between No.10 spring bacteria total DNA concentration and hydrochemistry

F-HCO3-HS-HgRnArN2CO2泉水細(xì)菌總DNA濃度Pearson相關(guān)性-0.298-0.376*-0.1100.251-0.1150.0210.0290.358*ThetotalDNAconcentration顯著性(雙側(cè))0.0650.0180.5050.1240.4860.9010.8590.025

注：*. 在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

Note：*. Significant correlation at 0.05 levels (bilateral)

3　討 論

有研究表明，微生物對(duì)環(huán)境變化做出生物應(yīng)答與生物防御的反應(yīng)十分敏銳，地震所引起的如地下流體、地磁、電離輻射、射線(xiàn)波、地震波等理化因子的環(huán)境變化會(huì)引起某些對(duì)地震敏感的微生物種群急劇變化，而這些敏感微生物可能會(huì)比對(duì)地震前兆反應(yīng)敏感的動(dòng)物更敏感，這也就是說(shuō)在地震帶存在著對(duì)地震很敏感的天然敏感菌[17]。項(xiàng)目組對(duì)10號(hào)泉水體微生物與地震關(guān)系的監(jiān)測(cè)持續(xù)多年，項(xiàng)目組成員張強(qiáng)等[18]于2010年12月至2011年4月，研究10號(hào)泉泉水細(xì)菌群落對(duì)有感地震的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌群落在地震后的豐富度均高于地震前，且都高于無(wú)地震時(shí)期; 羅嬌等[19]在2012年1月至2012年12月的研究表明有感地震發(fā)生后可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)目高于震前。楊紅梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)地震前可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)目顯著高于地震后；誘導(dǎo)泉水微生物系統(tǒng)中細(xì)菌群落變化的因素諸多，泉水中細(xì)菌群落為了應(yīng)對(duì)由地震帶來(lái)的環(huán)境改變會(huì)采取不同的生存策略，從而適應(yīng)變化的環(huán)境。研究繼張強(qiáng)、羅嬌等持續(xù)監(jiān)測(cè)，參考以往研究的結(jié)果及結(jié)論發(fā)現(xiàn)，除2015年3月13日，其余5次地震泉水細(xì)菌總DNA含量均為震前高于震后，且在地震發(fā)生后的5～17 d內(nèi)，泉水細(xì)菌總DNA含量變化出現(xiàn)極大值；這說(shuō)明該泉水中微生物對(duì)地震帶來(lái)的環(huán)境改變會(huì)做出適應(yīng)性的應(yīng)答反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)在2014年12月2日、2015年2月1日三次地震的震級(jí)依次遞增，細(xì)菌總DNA含量的極大值也隨之依次遞增。

泉水細(xì)菌總DNA含量與CO2有顯著的正相關(guān)性，分析其原因可能是泉水中的一些水文地球化學(xué)元素能夠作為電子受體(CO2)和電子供體(H2,CH4)為自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物的代謝提供能量[21]，例如在自然界中有些細(xì)菌能以CO2為碳源，將CO2合成有機(jī)物儲(chǔ)藏備用，這種代謝方式在碳循環(huán)的生物地球化學(xué)代謝中起了重要作用[22]，這與前人所研究的該泉水中古菌群落的豐度值與CO2含量呈現(xiàn)正相關(guān)性相吻合。朱成英等[23]的研究顯示來(lái)自深、淺源的溶解氣體CO2多表現(xiàn)為趨勢(shì)性高值中短期異常，在恢復(fù)背景值的過(guò)程中有地震發(fā)生，即水中溶解的CO2含量變化可對(duì)地震做短期預(yù)測(cè)。泉水細(xì)菌總DNA含量與HCO3-有顯著的負(fù)相關(guān)性，分析其原因可能為CO2在水中溶解，根據(jù)化學(xué)電離平衡方程可知，若CO2含量增加，HCO3-離子的含量就會(huì)減少，故就會(huì)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性。

4　結(jié) 論

烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量與地震的發(fā)生確實(shí)存在一定的響應(yīng)規(guī)律：泉水細(xì)菌總DNA含量變化基本符合震前高于震后，且隨震級(jí)的增加其最大恢復(fù)值也隨之而遞增；此外，在地震發(fā)生后的5～17 d內(nèi)，泉水體細(xì)菌總DNA含量變化出現(xiàn)極大值。

烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌群落與該泉水文地球化學(xué)因子HCO3-與CO2的含量變化關(guān)聯(lián)緊密，可作為后期重點(diǎn)觀(guān)測(cè)研究對(duì)象。

烏魯木齊10號(hào)泉水體細(xì)菌總DNA含量變化規(guī)律可作為地震預(yù)測(cè)的參考因素之一。

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Fund project:Supported by Hi-tech development project of Xinjiang Uygur Autonomous Region(201216145)

Analysis of the Seismic Response of Bacterial Community in Urumqi No. 10 Spring

CHEN Zhang1, 2, LIN Qing2, TANG Feng2, HU Rong2, YIN Ya-lan2, GAO Yan2

(1.CollegeofLifeScience,XinjiangNormalUniversity,Urumqi830054,China; 2.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi, 830091,China)

【Objective】 To sample No.10 spring water in Urumqi regularly, monitore the changes of total DNA concentration, and combine them with hydro geological data to explore the relationship between bacterial communities and earthquakes.【Method】Transformation clone method was used to establish the standard curve of absolute quantitative PCR. The density of bacterial communities in No.10 spring water was monitored by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】 The standard curve wasCp=-3.262 4LgC+25.075, Correlation coefficient wasr= 0.999，8; The density of bacterial community of No.10 spring in the monitoring period had a significant positive correlation with CO2, and a significant negative correlation with HCO3-.【Conclusion】 It is true that bacterial communities of the No.10 spring in Urumqi were sensitive to the seismic response. The total DNA concentration and the earthquake had a certain response: The change of total DNA concentration of No.10 spring was higher than that of the post earthquake, and the maximum recovery value increased with the increase of magnitude; The total DNA concentration of the spring water in the 5-17 days after the earthquake occurred, which had a great value, and this change is closely associated with hydrogen chemical factor HCO3-and CO2content change, so it can be used regard as the latter part of the focus of observation and research object. In a word, this might be one of the reference factors for earthquake prediction.

No.10 Spring in Urumqi; earthquake; real-time fluorescence quantitative PCR; bacterial community density; hydro geochemical

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.019

2015-12-07

新疆維吾爾自治區(qū)高新技術(shù)發(fā)展項(xiàng)目(201216145)

陳張(1989- )，女，新疆人，碩士研究生，研究方向?yàn)樾陆厣锓肿淤Y源可持續(xù)性應(yīng)用，(E-mail) zihanchenxj@163.com

高雁(1979- )，女，新疆人，副研究員，研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)，(E-mail) 47795411@qq.com

S182

A

1001-4330(2016)04-0730-07