杜明鳳， 丁貴杰

(1. 貴州大學 林學院， 貴陽 550025; 2. 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴陽 550025； 3. 貴州師范大學 喀斯特研究院， 貴陽 550001 )

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不同種源馬尾松ISSR遺傳結構及影響因素分析

杜明鳳1，2，3， 丁貴杰1，2*

(1. 貴州大學 林學院， 貴陽 550025; 2. 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴陽 550025； 3. 貴州師范大學 喀斯特研究院， 貴陽 550001 )

應用ISSR分子標記技術，對來自廣西、貴州3個種源的馬尾松開展遺傳多樣性、遺傳結構及遺傳距離等研究。結果表明：從100條引物中篩選出12條引物，共擴增出92個條帶，86條具有多態(tài)性。POPGENE分析顯示：馬尾松群體水平上的Nei’s基因多樣性指數(shù)的變化范圍為0.182 4～0.206 5，Shannon遺傳多樣性指數(shù)的變化范圍為0.281 8～0.317 8，3個群體的多態(tài)性水平差異不大；物種水平上的多態(tài)性百分率為93.48%，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.284 2，Shannon信息指數(shù)為0.438 1；表明馬尾松在物種水平上具有較高水平的遺傳多樣性。遺傳結構分析顯示：馬尾松的基因分化系數(shù)(Gst)為0.315 3，表明遺傳變異主要來源于群體內(nèi)；基因流Nm為1.085 3 ，表明不同群體間存在一定的基因流動。AMOVA分析顯示：馬尾松的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.246 (P=0.001)，表明群體間已出現(xiàn)明顯的遺傳分化。UPGMA聚類和Mantel檢測結果顯示：每個群體內(nèi)的個體均能很好地首先聚集為一個分支，群體間的遺傳距離與地理距離之間存在顯著相關性(r=0.972，P=0.001)。這說明馬尾松在裸子植物界中具有較高水平的遺傳多樣性，遺傳變異主要分布于群體內(nèi)，群體間已出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，這種分化并非由遺傳漂變引起，可能與地理生境的差異有關。

馬尾松, ISSR, 遺傳多樣性, 遺傳結構, 遺傳距離

馬尾松(Pinusmassoniana)屬裸子植物松科(Pinaceae)松屬(PinusLinn)，具有速生、豐產(chǎn)、適應能力強、分布廣泛、全樹綜合利用程度最高、經(jīng)濟價值高等優(yōu)良特性，是我國南方最主要的優(yōu)質(zhì)針葉用材樹種之一，在我國森林資源發(fā)展、林紙一體化、松香林產(chǎn)化工業(yè)及森林生態(tài)服務功能中占有重要地位(丁貴杰等，2006)。目前，馬尾松在造林栽培技術(丁貴杰等，2002)、經(jīng)營管理技術及應用(丁貴杰和周政賢，1996；丁貴杰，1998)等方面已取得成果。隨著分子標記技術的發(fā)展及應用，RAPD(萬愛華等，2008)、ISSR(張一等，2009)、SSR(譚小梅等，2012)等標記先后用于馬尾松種子園(萬愛華等，2008；張薇等，2008；譚小梅等，2012)、親本與子代之間(張一等，2010)的遺傳多樣性、遺傳改良等方面的研究，為馬尾松分子育種研究奠定了一定基礎。

由于馬尾松分子育種研究起步較晚，許多遺傳性狀機理、遺傳結構形成機制及相關因素等方面的研究相對缺乏；同時，高溫、干旱等異常氣候頻發(fā)加劇了生境的惡化，人為的強烈干擾致使馬尾松資源不可避免遭致破壞，其遺傳多樣性、基因流格局是否發(fā)生改變等問題，需要進一步深入研究。為此，本研究采用ISSR分子標記，對廣西、貴州3個不同種源馬尾松的遺傳多樣性、遺傳結構進行研究，以揭示馬尾松群體的遺傳分化水平及基因交流程度，并探究地理距離對遺傳結構的影響，為馬尾松引種、遺傳改良及資源保護提供參考，同時對認識馬尾松遺傳結構的形成機制具有一定的意義。

1　材料與方法

1.1 材料

材料來源于廣西和貴州3個不同的馬尾松人工林，均是廣西林科院選育的半同胞優(yōu)良家系，每個種源選擇24株生長良好的單株當年生嫩葉，共72個單株針葉樣品(具體信息見表1)，液氮速凍保存帶回實驗室置于-80 ℃冰箱中。

1.2 DNA提取

分別取-80 ℃下的每株嫩葉，于液氮中研磨成細粉狀，利用天根公司DNA secure Plant Kit(DP320-02)提取馬尾松基因組，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度后，用TE緩沖液稀釋DNA至25 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增與檢測

參照加拿大哥倫比亞UBC公司公布的ISSR引物序列，利用BIO-RAD t100 PCR擴增儀從100條引物 (上海生工合成) 中篩選出12條ISSR引物及退火溫度進行PCR擴增 (表2)。10 μL反應體系: 4 μL (25 ng·μL-1) DNA模板，0.4 μL (100 ng·μL-1) 引物，0.6 μL ddH2O, 5.0 μL Mix (Mix購自北京天根公司)，含0.1 U·μL-1Taq聚合酶，500 μmol·L-1dNTPs，20 mmol·L-1Tris-HCl (pH8.3)，100 mmol·L-1KCl，3 mmol·L-1MgCl2，其他穩(wěn)定劑和增強劑)。PCR反應程序:(1)預變性：94 ℃ 5 min；(2)擴增循環(huán)(40個循環(huán))：預變性94 ℃ 45 s,退火1 min,72 ℃ 45 s;(3)延伸：72 ℃ 10 min。設不加DNA模板的空白作為對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠 (內(nèi)含GoldView I型核酸染色劑) 電泳分離,在紫外分析儀上檢查。

表 1　材料及來源

表 2　ISSR引物序列與擴增情況

1.4 數(shù)據(jù)分析

每條引物PCR擴增重復3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計遵循以下原則：模糊不清、重現(xiàn)性差的譜帶不計，與陰性對照有相同遷移率的譜帶不計，分子量小于200 bp的譜帶不計。ISSR-PCR產(chǎn)物在凝膠的同一遷移率上，有帶賦值“1”(強帶和弱帶同記)，無帶賦值“0”, 得到原始數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE 32.0軟件估算多態(tài)性百分率(PPB)、等位基因數(shù)(Ao)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Shannon信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Nei’s基因分化指數(shù)(Gst)、基因流(Nm)等遺傳參數(shù)分析；利用AMOVA 1.55軟件(張富民等，2002)對群體間、群體內(nèi)的遺傳變異進行分析；利用NTSYS-pc2.10e軟件根據(jù)遺傳距離構建UPGMA聚類圖；利用ARCGIS軟件計算不同種源的地理距離；利用R軟件對遺傳距離與地理距離進行Mantel檢驗。

2　結果與分析

2.1 ISSR引物的擴增片段效果

從100條引物中篩選出12條穩(wěn)定清晰、重復性好、 多態(tài)性高的引物(表2)， 對3個種源72份材料進行ISSR-PCR擴增，共擴增出92個條帶， 86個條帶具有多態(tài)性，多態(tài)位點百分率為93.48%，條帶大小200～1 500 bp不等，500～1 000 bp內(nèi)的多態(tài)性片段最多。平均每條引物擴增7.7條，其中引物857擴增條帶最多，為11條，引物841擴增條帶最少，為6條；不同引物擴增條帶的多態(tài)位點百分率在66.67%～100%之間，其中引物808、818、846、857檢測效率最高，其檢測位點的多態(tài)性百分率為100%，引物841最低，為66.67%。

圖 1　ISSR引物857擴增DNA片段　M. 分子量標記； 1-24. GX1居群； 25-48. GX2居群； 49-72. GZ居群。Fig. 1　ISSR amplified bands of primer 857　M. Marker; 1-24. Population GX1; 25-48. Population GX2; 49-72. Population GZ.

2.2 馬尾松遺傳多樣性

由表3可知，在物種水平上，72份材料的多態(tài)位點百分率為93.48%、觀測等位基因數(shù)為1.934 8、有效等位基因數(shù)為1.461 9、Nei’ s基因多樣性指數(shù)為0.284 2、Shannon信息指數(shù)為0.438 1。群體水平上，3個群體的多態(tài)位點百分率在64.13%～71.74%之間，平均為66.67%；觀測等位基因數(shù)變幅為1.641 3～1.717 4，平均為1.666 7；有效等位基因數(shù)變幅為1.300 3～1.345 8，平均為1.322 2； Nei’ s基因多樣性指數(shù)在0.182 4～0.194 8之間，平均為0.194 6；Shannon信息指數(shù)為0.281 8～0.317 8之間，平均為0.299 6。根據(jù)Nei’s指數(shù)和Shannon指數(shù)的大小變化可知，物種水平上的遺傳多樣性高于群體水平；不同群體間，GX2的遺傳多樣性水平最高，GZ其次，GX1最低。

表 3　不同種源馬尾松ISSR遺傳多樣性

表 4　不同種源馬尾松的遺傳結構

表 5　不同種源馬尾松遺傳變異的AMOVA分析

2.3 馬尾松遺傳分化

從表4可知，由Nei’s指數(shù)估算得出的群體間基因分化系數(shù)Gst為0.315 3，群體間的基因流為1.085 3,表明群體間存在基因交流；由Shannon指數(shù)估算得出總遺傳變異中，68.37%源于群體內(nèi)，31.61%源于群體間，均表明馬尾松的遺傳多樣性主要來自于群體內(nèi)不同個體的遺傳差異。運用AMOVA對馬尾松3個群體的遺傳分化系數(shù)進行分析，結果顯示(表5)：馬尾松的77.28%遺傳變異來源于群體內(nèi)，22.72%的遺傳變異來源于群體間，與Nei’ s指數(shù)和Shannon指數(shù)的估算結論一致；遺傳分化指數(shù)Fst表明,馬尾松群體間的遺傳分化雖只占總遺傳分化的小部分，但其遺傳分化水平表現(xiàn)出極顯著差異(Fst=0.246,P=0.001)。

2.4 馬尾松遺傳距離與聚類分析

由表6可知，馬尾松3個群體間的遺傳距離范圍為0.096 0～0.269 7，其中GX1和GX2的遺傳距離最小(0.096 0)，遺傳相似度最大；GX1與GZ的遺傳距離最大(0.269 7)，遺傳相似度最小。利用遺傳相似系數(shù)(Gs)構建的UPGMA聚類圖(圖2)顯示，3個群體內(nèi)的個體植株均能較好地聚在一起；當閾值取0.68時，GX1與GX2聚為一支，GZ單獨聚成一支；說明GX1與GX2親緣關系較近，兩者與GZ的親緣關系較遠。通過Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)，3個馬尾松群體間的遺傳距離與其地理距離具有顯著相關性(r=0.972,P=0.001),說明馬尾松群體間的遺傳多樣性具有明顯的地域分布規(guī)律。

表 6　不同種源馬尾松遺傳距離 (對角線下方)

圖 2　不同種源馬尾松的ISSR聚類圖Fig. 2　Clustering of different populations of P. massoniana

3　討論與結論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存和發(fā)展的前提，物種的遺傳多樣性水平越高意味著適應環(huán)境變化的能力就越強，遺傳變異的大小決定其進化速率的快慢(Barrett & kidwell,1998)。本研究通過對廣西、貴州的3個種源72份材料的ISSR分析得出，馬尾松在物種水平上的多態(tài)位點百分率、Nei’s指數(shù)、Shannon指數(shù)分別為93.48%、0.284 2、0.438 1，與朱亞艷等(2014)、王茜等(2013)、張一等(2009)的研究結果(多態(tài)位點百分率為82.25%～94.35%、Nei’s指數(shù)為0.276 5～0.378 9、Shannon指數(shù)為0.427 8～0.550 3)相類似，表明馬尾松在物種水平上具有豐富的遺傳多樣性，這與Chen et al(2013)、Liao et al(2012)的研究結論一致，即自然分布較廣的物種一般都具有較高的遺傳多樣性；這也是其在惡劣環(huán)境下具有較強生存適應能力的重要原因之一。與裸子植物相比，略低于油松(郝真真,2009)、華山松(趙楊等,2012) (多態(tài)位點百分率為92.81%～100%、Nei’s指數(shù)為0.334 1～0.402 9、Shannon指數(shù)為0.448 0～0.585 5)，高于云南松(楊章旗,2014)、紅松(賈俊玲,2011)、紅豆杉(李乃偉等,2011)、臺灣杉(李江偉等,2014) (多態(tài)位點百分率為74.62%～82.19%、Nei’s指數(shù)為0.207 6～0.256 0、Shannon指數(shù)為0.322 9～0.377 8)；整體而言，馬尾松的遺傳變異豐富，在裸子植物界中處于較高水平。

3.2 遺傳結構

掌握物種的遺傳結構即遺傳變異在種群間的分布，是物種保護繁育的重要基礎和前提。影響物種遺傳分化的主要因素包括遷移、突變、重組、自然選擇、地理隔離、遺傳漂變、基因流等(Viki et al,2013)。本研究發(fā)現(xiàn)，Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)及AMOVA分析結果相似，即馬尾松遺傳多樣性主要分布于群體內(nèi)(Gst=0.3153)，群體間存在著一定的基因交流(Nm=1.0853)。這與Nybom & Bartish(2000)認為壽命長、異交的植物類群其遺傳變異主要來源于群體內(nèi)部的研究結論一致，同時也表明其群體內(nèi)個體選優(yōu)的潛力很大。但與譚小梅等(2012)、艾暢等(2006)的研究數(shù)據(jù)存在差異(其基因分化系數(shù)Gst分別為0.050 4、0.076 7)；上述研究針對種子園內(nèi)不同群體展開，各群體的生態(tài)環(huán)境相對一致；馬尾松是典型風媒異交物種，其花粉小，能借助風媒傳播，加之人工授粉輔助，可加大種子園內(nèi)不同群體間的基因流動，因而表現(xiàn)出其群體間的分化很小，這與本研究來自不同省份的種源材料在地理距離上、生態(tài)環(huán)境等方面差異較大。

由于多數(shù)馬尾松的研究結果均顯示其遺傳變異主要來源于群體內(nèi)，因此對于馬尾松群體間的遺傳分化情況關注很少。本研究通過AMOVA分析發(fā)現(xiàn)，馬尾松群體間的遺傳分化雖然僅占其小部分，但已出現(xiàn)顯著差異(Fst=0.246,P=0.001)，這與油松(孟翔翔等，2013)、臺灣杉(李江偉等，2014)等研究結果相似，暗示馬尾松種群在長期進化過程中可能產(chǎn)生了分化。Wight(1931)認為Nm>1時，基因流能防止由遺傳漂變引起的群體間的遺傳分化；本研究中Nm=1.085 3，說明馬尾松群體間存在基因交流，其遺傳分化并非由遺傳漂變引起。

3.3 遺傳距離

Fischer(2000)認為物種的遺傳距離與地理距離之間不相關，意味著遺傳漂變可能是導致群體間遺傳分化的主導因素。本研究發(fā)現(xiàn)，遺傳距離與地理距離之間具有顯著相關性(r=0.972,P=0.001)，生境來源相近的家系QG83和QG111首先聚在一起，兩者與貴州的QM01群體具有較遠的親緣關系；相比而言，QG83與QM01的遺傳距離比QG111與QM01之間的更遠，與其地理差異一致，表明馬尾松群體間的遺傳多樣性呈現(xiàn)一定的地理分布規(guī)律。綜合上述結果，可初步推斷引起馬尾松群體間遺傳分化的主要因素并非遺傳漂變而可能是地理差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，廣西2個種源均為低緯度地區(qū)；防城港臨海，屬于海洋性季風氣候，海拔在100 m以內(nèi)；百色市地處珠江水系上游，典型山區(qū)，屬于亞熱帶季風濕潤氣候，平均海拔500 m；貴州種源麻江地處云貴高原向湘桂丘陵過渡的斜坡地帶，以山地為主，屬亞熱帶季風濕潤氣候，平均海拔930 m。各自的地理位置、氣候特征、海拔、地形、土壤以及水熱條件等生態(tài)環(huán)境均有差異，各自形成不同的小生境。盡管馬尾松具有風媒、異交等生物學特性，研究結果亦顯示群體間存在一定基因交流，但面臨長距離、海拔梯度大的實際情況，其后代向外擴散的能力是非常有限的。因此，馬尾松很可能在不同生境下經(jīng)過長期的進化，逐漸形成不同的適應機制，因而開始呈現(xiàn)出群體間的遺傳分化。

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Analysis of genetic structure and its related factors ofPinusmassonianafrom different populations by ISSR marker

DU Ming-Feng1,2,3, DING Gui-Jie1,2*

( 1.CollegeofForestry,GuizhouUniversityGuiyang, Guizhou 550025, China; 2.ResearchCentreofForestResourcesandEnvironment,Guiyang 550025, China; 3.SchoolofKarstScience,GuizhouNormalUniversity, Guizhou 550001, China )

ISSR markers were used to study the genetic diversity, genetic structure and genetic distance of three populations ofPinusmassonianafrom Guangxi Zhuang Autonomous Region and Guizhou provinces. Of the 100 primers screened,12 primers were selected and they generated 92 stable bands, among which 86 bands were polymorphic. The result of POPGENE indicated that Nei’ s gene diversities (h) at population level were from 0.182 4 to 0.206 5, Shannon’s information indexes (I) at population level were from 0.281 8 to 0.317 8, which suggested that the polymorphism level of three populations had small differences. At species level, the percentage of polymorphic bands (PPB) were 93.48%, Nei’s gene diversities (H) was 0. 284 2, Shannon’s information index (I) was 0.438 1. All those showed thatP.massonianahad a higher genetic diversity at the species level. The analysis of genetic structure indicated that the average coefficient gene differentiation (Gst) was 0.315 3, which implied most of genetic variation appeared inner population. And the average number of the gene flow was 1.085 3, which indicated that there were a certain degree of gene exchanges between each population ofP.massoniana. The result of AMOVA showed that the genetic differentiation index was 0.246 (P=0.001), which indicated that the genetic differentiation was evident among different populations although there were gene exchanges between them. The UPGMA clustering and Mantel test showed that every individual inner population was first gathered for a branch. And there was significant correlation between the genetic distance and geographical distance among these three populations(r=0.972,P=0.001). Therefore, it was concluded from above that theP.massonianawas at a higher level of genetic diversity in gymnosperms; and the majority of genetic variation distributed within population; and the genetic differentiation from different populations ofP.massonianawas hardly associated with the genetic drift but maybe caused by the difference from geographical and ecological environments. This study will provide theoretical reference and scientific basis for genetic improvement and plant introduction ofP.massoniana.

Pinusmassoniana, ISSR, genetic diversity, genetic structure, genetic distance

10.11931/guihaia.gxzw201507001

2015-07-07

2015-08-20

國家自然科學基金 (31260183)；國家“863”項目 (2011AA10020301)；貴州省重大專項(黔科合重大專項字 [2012]6001號)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31260183)； National 863 Program (2011AA10020301)； Special Key Program of Guizhou Province ([2012]6001)]。

杜明鳳(1979-),女,貴州惠水人,博士研究生,副教授,主要從事森林培育、植物分子遺傳與育種研究，(E-mail)dmf1979@126.com。

丁貴杰,教授,博士生導師,主要從事森林培育研究,(E-mail) gjdinggzu@ 126.com。

Q943；S718.3

A

1000-3142(2016)09-1068-08

杜明鳳，丁貴杰. 不同種源馬尾松ISSR遺傳結構及影響因素分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1068-1075

DU MF, DING GJ. Analysis of genetic structure and its related factors ofPinusmassonianafrom different populations by ISSR marker [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1068-1075