遲莉麗　宋欽蘭　程　艷　孫大娟　閆　華　梁峻尉　王　帥　袁　浩

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南，250011； 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南，250355)

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實(shí)驗(yàn)研究

中藥安腸愈瘍湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量及NF-κB表達(dá)的影響

遲莉麗1宋欽蘭1程艷1孫大娟1閆華1梁峻尉1王帥1袁浩2

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南，250011； 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南，250355)

目的：觀察中藥復(fù)方安腸愈瘍湯對潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量及NF-κB表達(dá)的影響，以探討其作用機(jī)制。方法：將90只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組(空白對照組，模型對照組，安腸愈瘍湯低、中、高劑量組和美沙拉嗪組)。除空白組外，其他各組均應(yīng)用三硝基苯磺酸(TNBS)制備UC大鼠模型，造模成功后，按照組別分別給予不同劑量的實(shí)驗(yàn)藥物，連續(xù)給藥3周后，進(jìn)行結(jié)腸組織肉眼形態(tài)評分，同時(shí)采用ELISA法檢測結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量，免疫組化法檢測NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果：安腸愈瘍湯中、高劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜均有不同程度的炎癥修復(fù)、潰瘍愈合(P<0.01或P<0.05)，其中高劑量組及美沙拉嗪組明顯優(yōu)于中、低劑量組，但2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在IL-6方面，安腸愈瘍湯低、中、高劑量組及美沙拉嗪組的含量均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中，高劑量組及美沙拉嗪組明顯優(yōu)于中、低劑量組(P<0.01)，但2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在IL-13方面，安腸愈瘍湯中、高劑量組及美沙拉嗪組的含量均不同程度升高(P<0.01或P<0.05)，尤以高劑量組效果最好，與美沙拉嗪組比較有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在NF-κB表達(dá)方面，安腸愈瘍湯中、高劑量組及美沙拉嗪組均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量組效果最好，但與美沙拉嗪組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：安腸愈瘍湯具有較好的抗炎和促進(jìn)潰瘍修復(fù)的作用，可能是通過下調(diào)致炎因子IL-6，上調(diào)抗炎因子IL-13，同時(shí)降低NF-κB表達(dá)，從而起到治療UC的作用。

潰瘍性結(jié)腸炎；中藥安腸愈瘍湯；IL-6；IL-13；NF-κB；實(shí)驗(yàn)研究

UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但免疫反應(yīng)異常被認(rèn)為在UC的發(fā)病中扮演重要角色。該病目前尚缺乏滿意的治療方法，已被WHO列為現(xiàn)代難治病之一[1-4]，尋求中醫(yī)藥治療UC已成為目前研究熱點(diǎn)。課題組通過前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，中藥安腸愈瘍湯能夠使結(jié)腸組織中IL-1β、IL-8、TNF-α含量降低，而升高IL-10的含量。本研究進(jìn)一步觀察其對UC大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量及對NF-κB表達(dá)的影響，以期從分子生物學(xué)水平探討安腸愈瘍湯治療UC的深層機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料SPF級Wistar大鼠90只，鼠齡10～11周，雌雄各半，體重(200±10)g。由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證SCXK(魯)2013-0001。

1.2受試藥物安腸愈瘍湯(生黃芪、薏苡仁、炒白術(shù)、黃連、黃芩、敗醬草、白及、地榆炭、木香、檳榔、當(dāng)歸、白芍、防風(fēng)、生甘草)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑室提供，含生藥量為3 g/mL；美沙拉嗪緩釋顆粒，生產(chǎn)企業(yè)Ethypharm，法國，批號：14379。

1.3試劑2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)水溶液：購于上海源葉生物科技有限公司，批號：080M5000，產(chǎn)自Sigma公司；進(jìn)口分裝大鼠IL-6、IL-13定量試劑盒、即用型SABC免疫組化染色試劑盒:SA1022(內(nèi)含5%BSA封閉液,山羊抗兔IgG,鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒：AR1022均購自濟(jì)南博諾生物科技有限公司；

1.4儀器可調(diào)高速勻漿器FSH-2型，金壇市恒豐儀器廠；酶標(biāo)儀:ELX808,Bio Tek美國伯騰儀器有限公司；高速低溫離心機(jī)MICROMAX RF，Thermo IEC(美國)。

2　方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組與造模適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周后隨機(jī)分為6組：空白對照組、模型對照組、安腸愈瘍湯低、中、高劑量組、美沙拉嗪組，(以下簡稱空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、5-ASA組)每組15只，除空白組外，其余5組大鼠均采用TNBS法造模[8]，將大鼠禁食(不禁水)24 h后，用10%水合氯醛行腹腔麻醉，用直徑2.0 mm，長12 cm的硅膠管插入肛門約8 cm，以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合試劑快速注入肛門后，提尾倒立1 min，待自然蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2給藥劑量及途徑造模后第3天開始藥物灌胃：中藥低、中、高劑量組分別給予含生藥為0.75 g/mL、1.5 g/mL、3 g/mL的中藥灌胃，5-ASA組用0.035 g/mL的美沙拉嗪混懸液灌胃，空白組、正常組：均以蒸餾水灌胃。以上各組均每次2 mL，2次/d，連續(xù)3周。(實(shí)驗(yàn)過程中模型組、中藥小劑量組、5-ASA組各死亡1只大鼠)

2.3標(biāo)本采集及結(jié)腸組織形態(tài)評分給藥3周后，處死大鼠，分離結(jié)腸，取出距肛門以上約8 cm結(jié)腸段，沿腸系膜縱軸剪開，冰生理鹽水沖洗，肉眼觀察各組大鼠結(jié)腸組織，參照Luketal標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行大體形態(tài)評分，再留取各組病變組織置-80 ℃冰箱速凍保存，以備檢測。

2.4ELISA法檢測IL-6、IL-13含量向預(yù)先包被IL-6、IL-13抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌，用底色TNB顯色，TNB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，計(jì)算樣品濃度。

2.5免疫組化法檢測結(jié)腸組織NF-κB p65的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)各組中每組隨機(jī)抽取6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一檢測，方法：采用經(jīng)典的SABC法,具體步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作,以PBS代替一抗為陰性對照,采用Image pro plus4.0軟件進(jìn)行圖像分析。染色強(qiáng)度分為0-3級，0=陰性染色；1=弱陽性染色；2=中度陽性染色；3=強(qiáng)陽性染色。每個(gè)樣本所見陽性細(xì)胞范圍分為0-4級，0=陰性；1=陽性細(xì)胞占1%～25%；2=陽性細(xì)胞占26%～50%；3=陽性細(xì)胞占51%～75%；4=陽性細(xì)胞占76%～100%。每張切片評分以上述兩者之積表示。

3　結(jié)果

3.1結(jié)腸粘膜損傷情況結(jié)果顯示，模型組評分明顯高于空白組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。中藥中、高劑量組及5-ASA組評分均不同程度降低(P<0.01或P<0.05)，其中，高劑量組及5-ASA組明顯優(yōu)于中劑量組，但2組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1　大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評分比較

注：與模型組比較#P<0.05，##P<0.01，△P>0.05;與正常組比較▲P<0.01。

3.2結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量測定結(jié)果結(jié)果顯示，中藥低、中、高劑量組及5-ASA組IL-6的含量均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中，中藥高劑量組及5-ASA組明顯優(yōu)于中藥中、低劑量組(P<0.01)，但2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中藥中、高劑量組及5-ASA組IL-13的含量均不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，尤以中藥高劑量組最好，與5-ASA組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-13含量的比較

注：與模型組比較#P<0.05，##P<0.01；與正常組比較▲P<0.01；與5-ASA比較△P<0.05。

表3　大鼠結(jié)腸組織NF-κB檢測結(jié)果(n=6)

注：與模型組比較##P<0.01，#P<0.05，與正常組比較▲P<0.01，與5-ASA比較△P<0.05。

3.3結(jié)腸組織中NF-κB、p65的檢測結(jié)果結(jié)果顯示，中藥中、高劑量組及5-ASA組NF-ΚB陽性表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中以中藥高劑量組效果最好(P<0.01)，但與5-ASA組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

4　討論

UC可歸屬中醫(yī)學(xué)“休息痢”“久痢”之范疇?；诒静〉淖C候?qū)W演變規(guī)律，我們認(rèn)為本病始終存在著脾失健運(yùn)、濕熱蘊(yùn)腸、氣血淤滯、內(nèi)瘍形成的病理機(jī)制，并根據(jù)“虛毒瘀”理論，確立了健脾益氣、清解化濕、調(diào)氣和血之治療大法。方中黃芪、白術(shù)，二藥合用，補(bǔ)虛安中，健脾益氣；薏苡仁健脾滲濕，清熱排毒止瀉，三藥共用為君藥；黃連、黃芩清熱燥濕止痢，地榆涼血止血三藥共為臣藥。木香、檳榔行氣導(dǎo)滯，破結(jié)消積。白芍緩急止痛；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，與木香、檳榔相伍有“調(diào)氣則后重自除，行血?jiǎng)t便膿自愈”之意。敗醬草清熱解毒，消癰排膿，白及收斂止血，消腫生肌。配少量防風(fēng)取其升散腸風(fēng)之性。甘草清熱解毒、緩急止痛，兼司佐使之職，整方標(biāo)本兼治，切合病機(jī)。

研究表明IL-6作為促炎因子，在UC的發(fā)病中起至關(guān)重要的作用[10-11]。IL-13作為抗炎因子，可抑制單核巨嗜細(xì)胞分泌前炎癥性細(xì)胞因子和下調(diào)有細(xì)胞毒性的單核功能，與IL-4或IL-10聯(lián)合具有協(xié)同抗炎作用[12-13]。另外，越來越多的研究表明[14-16]NF-κB作為一種調(diào)節(jié)各種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有轉(zhuǎn)錄激活功能，其活化異常是UC的病理生理學(xué)機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量安腸愈瘍湯具有明確治療UC的作用，不僅可使UC大鼠的結(jié)腸組織黏膜得到明顯修復(fù)與改善，并可升高IL-13的含量，降低IL-6的含量，同時(shí)還能明顯降低NF-κB的表達(dá)。由此推測，安腸愈瘍湯可是通過抑制NF-κB的表達(dá)，減弱了其作為啟動(dòng)蛋白的炎性反應(yīng)鏈的擴(kuò)大，減少促炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗炎作用。另一方面，安腸愈瘍湯還通過增加保護(hù)因子的釋放，從而達(dá)到防治UC的作用。然而這些細(xì)胞因子是直接作用于腸道黏膜組織而發(fā)揮修復(fù)作用還是通過抑制TLR4/NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性反應(yīng)而發(fā)揮增強(qiáng)粘膜修復(fù)的作用，其深層機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(2015-07-12收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Anchang Jieyu Decoction on the Expression of IL-6, IL-13 and NF-κB in Ulcerative Colitis Mice

Chi Lili1, Song Qinlan1, Cheng Yan1, Sun Dajuan1, Yan Hua1, Liang Junwei1, Wang Shuai1, Yuan Hao2

(1 Affiliated Hospital to Shandong University of Chinese Medicine, Jinan 250011, China;2ShangdongUniversityofChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective:To explore the mechanism of Anchang Jieyu decoctiona by detecting its effect on the expression of IL - 6, IL - 13 and NF - kB in rats with ulcerative colitis(UC).Methods:Ninety Wistar rats were randomly divided into six groups(blank control group, model control group, Anchang Jieyu decoctiona low, medium, high dose group and Solfasalazine(5-ASA) group). Except for the blank group, the other groups were given trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS) to produce rat model of UC. Different groups were given different dose of drugs respectively. After 3 weeks' administration, colon tissue of the eye morphology scores, IL-6, IL-13 content, and NF-κB protein expression were detected.Results:Rats in Anchang Jieyu decoctiona low, medium, high dose group and 5-ASA group showed varying degrees of improvement and ulcer healing(P<0.01 orP<0.05), of which the high dose group and the 5-ASA were superior to others, but comparison between the two groups showed no statistical significance(P>0.05); In level of IL - 6, TCM low, medium and high dose group and the 5-ASA group were differently lower(P<0.05 orP<0.01). Among them, the high dose group and the 5-ASA were superior to middle and low dose group (P<0.01), but no statistical significance had showed between the two groups (P>0.05); In level of IL - 13, TCM high dose group and 5-ASA group were differently increased (P<0.01 orP<0.05), especially in high dose group. Besides, compared with 5-ASA group, there was significant differences(P<0.05); In level of NF - kB, TCM medium, high dose group and 5-ASA group have declined (P<0.05 orP<0.01), in which the effect of high dose group performed the best. While compared with 5-ASA group, there were no statistical significance (P>0.05).Conclusion:Anchang Jieyu decoction performs better in anti-inflammation and ulcer repair promotion. This may through down regulating pro-inflammatory cytokines IL-6, up regulating anti-inflammatory cytokines IL-13, and inhibiting the expression of NF-κB, which contribute a lot to the treatment of UC.

Ulcerative colitis; Anchang Jieyu decoction; IL-6; IL-13; NF-κB; Experiment

山東省自然科學(xué)基金(編號：ZR2012HL11)——“潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織NF-κB、TLR-4表達(dá)與其損傷關(guān)系及中藥復(fù)方干預(yù)的研究”

遲莉麗(1962.9—)，女，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脾胃病科科主任，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療消化系統(tǒng)疾病研究工作，E-mail：chililiyl@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.030