孫　琪，陳　帆

(溫州大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 溫州　325035)

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分析測試新方法(169～178)

一種測定植物甾醇的高靈敏度衍生化HPLC-MS/MS方法

孫琪，陳帆

(溫州大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 溫州325035)

建立以丹磺酰肼為柱前衍生試劑，采用Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×3.0 mm，2.7 μm)反相色譜柱，甲醇-水(體積比為99∶1)為流動相，流速為 0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，電噴霧電離源，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)方式正離子檢測，測定豆甾醇、β-谷甾醇、巖藻甾醇、麥角甾醇的柱前衍生化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法. 同時(shí)分析測定羊棲菜、海帶、紫菜中的甾醇種類及含量. 以膽固醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量，各甾醇線性范圍在0.05～100 μg/mL之間，相關(guān)系數(shù)在0.990 3～0.998 1之間，檢出限(LODs)在0.2～20 ng/mL之間，定量限(LOQs)在0.667～66.7 ng/mL 之間，甾醇類物質(zhì)靈敏度比高效液相色譜法提高25～500倍.

植物甾醇；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；柱前衍生化；選擇反應(yīng)監(jiān)測

植物甾醇是一類天然活性物質(zhì)的總稱. 雖然它們在植物性食物中含量很少，卻具有較高的食用和藥用價(jià)值. 藥理學(xué)研究表明，植物甾醇能有效降低膽固醇，具有抗炎、抗癌、抗氧化的功能，同時(shí)還具備調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)人體甾體激素等作用. 有些甾醇也是維生素D、甾族化合物以及多種激素合成的前體物質(zhì)[1-6]. 因此，對植物甾醇分析研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義.

植物甾醇的定量分析方法主要有毛地黃皂苷法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、高速逆流色譜法等[7-14]. 最早期方法多為毛地黃皂苷法，但因其價(jià)格貴、分析耗時(shí)、操作繁瑣、多干擾因素而逐漸被淘汰. 高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，但是單一的色譜法有時(shí)定性并不完全準(zhǔn)確，因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法剛好彌補(bǔ)這一缺點(diǎn).

就目前報(bào)道的文獻(xiàn)中，鮮有衍生化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析植物甾醇. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的電噴霧電離(ESI)源遠(yuǎn)比氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的化學(xué)電離(EI)源溫和，更容易控制碎裂程度，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰，方便獲得分子結(jié)構(gòu)信息. 因此本研究是一種將衍生與液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合的方法. 首先采用較溫和且適合天然產(chǎn)物的戴斯馬丁(DMP)[15-16]氧化劑將甾醇氧化成酮，再用丹磺酰肼[17-18]與酮發(fā)生腙化反應(yīng)，最后進(jìn)樣分析. 采用二級質(zhì)譜，定性能力大大提高，因此液相色譜不必完全分離所有組分. 選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式提高選擇性，大大節(jié)省分析時(shí)間. 衍生化反應(yīng)[19]的目的是引入容易離子化的基團(tuán)，使目標(biāo)物的離子化效率增強(qiáng)，從而提高儀器檢測的靈敏度. 因此，該方法的建立為植物甾醇以及具有相似結(jié)構(gòu)的類固醇、維生素D2(VD2)，維生素D3(VD3)等的分析研究提供理論依據(jù).

1　試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；LCQ DECA XP Plus液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Finnigan)；KQ-250D型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；海爾超低溫保存箱；FD-IC-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(上海啟前電子科技有限公司)；BUCHI Rotavapor R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AL106電子天平(梅特勒-托力多儀器有限公司)；可調(diào)量程移液器(德國Eppendorf公司).

甲醇、乙醇(色譜純，北京百靈威科技有限公司)，其他試劑均為分析純；水為超純水(Milli-Q超純水制備)；丹磺酰肼(98%)，戴斯馬丁氧化劑，15wt%二氯甲烷溶液 (DMP)，麥角甾醇(98%)，豆甾醇(95%)，β-谷甾醇(98%)，巖藻甾醇(98%)，膽固醇(98%) ，均購自北京百靈威科技有限公司；羊棲菜采摘自浙江溫州洞頭海域，紫菜、海帶均為市售.

1.2儀器工作條件

高效液相色譜(HPLC)條件：Agilent Poroshell 120 EC-C48反相色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7 μm)；流動相：甲醇-水(體積比為99∶1)；柱溫：室溫；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL. 電噴霧離子源(ESI)條件：正離子模式，電噴霧電壓為4 kV；加熱毛細(xì)管溫度為350 ℃；氮?dú)?N2)壓力為0.65 MPa；氦氣(He)壓力為0.25 MPa；鞘氣流速20 arb；輔助氣流速為5 arb.

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.005 g植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品和0.005 g膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，分別用二氯甲烷溶解并定容于10 mL容量瓶，搖勻，得質(zhì)量濃度為0. 5 mg /mL植物甾醇儲備液和0. 5 mg /mL膽固醇儲備液.

1.4衍生化反應(yīng)

用0. 5 mg /mL的植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制一系列濃度的甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度均含10 μL 0. 5 mg /mL的膽固醇儲備液作為內(nèi)標(biāo)，加入6 μL DMP，35 ℃左右超聲40 min，第一步氧化反應(yīng)完畢. 反應(yīng)液用N2吹干，加入150 μL丹磺酰肼衍生劑、6 μL對甲苯磺酸，40 ℃左右超聲30 min，第二步反應(yīng)完畢. 用甲醇稀釋至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣分析. 以麥角甾醇為例，植物甾醇衍生反應(yīng)機(jī)理如圖1、2所示.

圖1　DMP氧化甾醇反應(yīng)機(jī)理Fig.1　Reaction mechanism of phytosterol and DMP

圖2　丹磺酰肼衍生甾酮[19]反應(yīng)機(jī)理Fig.2　Dansyl hydrazine derivative reaction mechanism

1.5樣品前處理

第一步氧化反應(yīng)所用的戴斯馬丁氧化劑具有較高選擇性，較溫和的反應(yīng)條件，能直接有效地將仲醇氧化成酮，更適合天然產(chǎn)物的反應(yīng)，并且反應(yīng)后處理簡單，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，因此是一種環(huán)境友好的氧化劑. 丹磺酰肼與羰基的腙化反應(yīng)條件簡單、快速，反應(yīng)過程會發(fā)生貝克曼重排，這些中間產(chǎn)物也會提高質(zhì)譜的離子化效率，增加靈敏度.

1.6羊棲菜樣品溶液的制備

羊棲菜用蒸餾水洗凈，置于超低溫冰箱冷凍24 h，冷凍干燥機(jī)干燥24 h，將干燥后的羊棲菜粉碎過篩，裝瓶待用. 準(zhǔn)確稱取1.000 g羊棲菜粉末，50 ℃下用40 mL乙醇超聲功率90 W提取90 min，減壓抽濾，濾液于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干. 向上述蒸干溶劑的茄形瓶中加KOH-C2H5OH溶液(2 mol/L,20 mL)，60 ℃下皂化90 min. 皂化結(jié)束，溶液冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)溶劑，然后向其中加10 mL水溶解，水相分別用10 mL正己烷萃取3次，取正己烷相合并，蒸干溶劑，用二氯甲烷定容10.00 mL，取100 μL按1.4所述進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后用甲醇定容1.00 mL，過0.22 μm微孔濾膜進(jìn)樣分析.

2　結(jié)果與討論

2.1衍生化條件優(yōu)化

2.1.1衍生劑體積的選擇

丹磺酰肼與甾醇不會完全反應(yīng)，同時(shí)由于第一步氧化劑剩余，因此需要過量衍生劑對甾醇衍生，盡可能定量轉(zhuǎn)化，所以試驗(yàn)考察了衍生劑的體積分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.5 mL時(shí)，產(chǎn)物濃度的變化情況. 試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著衍生劑用量增加，產(chǎn)物濃度增加，當(dāng)超過0.15 mL時(shí)，產(chǎn)物濃度不再增加，故選擇衍生劑的體積0.15 mL. 衍生產(chǎn)物峰面積強(qiáng)度隨衍生劑用量的變化趨勢如圖3所示.

2.1.2衍生化時(shí)間的選擇

保持衍生溫度和用量不變，在60 min內(nèi)，考察時(shí)間對衍生效率的影響. 使用相同濃度的甾醇標(biāo)準(zhǔn)品混合液與衍生劑反應(yīng)不同時(shí)間后測定，結(jié)果表明，反應(yīng)30 min后，各甾醇衍生物峰面積達(dá)到最大且基本恒定，故選擇衍生化時(shí)間為30 min. 衍生產(chǎn)物峰面積強(qiáng)度隨衍生時(shí)間的變化趨勢如圖4所示.

2.1.3衍生化溫度的選擇

在20～60 ℃之間，考察溫度對衍生效率的影響，結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見，隨著溫度升高，各甾醇衍生物峰面積不斷增大，當(dāng)溫度超過40 ℃，衍生效率明顯降低，故選擇40 ℃作為最佳衍生化溫度.

圖3　衍生劑體積對衍生化效率的影響Fig.3　Effect of derivative agent volume on efficiency of derivatization

圖4　反應(yīng)時(shí)間對衍生化效率的影響Fig.4　Effect of reaction time on efficiency of derivatization

圖5　反應(yīng)溫度對衍生化效率的影響Fig.5　Effect of reaction temperature on efficiency of derivatization

2.2液質(zhì)條件優(yōu)化

2.2.1液相色譜條件

植物甾醇是一類低極性化合物，親水性很差，通過查閱文獻(xiàn)，考察100%甲醇作流動相，每種待測組分可在10 min內(nèi)出峰，且峰型較優(yōu)，各甾醇衍生物色譜圖如圖6所示. 但由于甲醇較強(qiáng)的洗脫能力使各組分不能較長保留使組分得不到較好分離，因此考察甲醇-水(體積比為99∶1) 作流動相，結(jié)果表明，甲醇-水能增加各組分保留值，各甾醇衍生物色譜圖如圖7所示. 由圖7可見，分離較好，因此選擇甲醇-水(體積比為99∶1)作為流動相. 本試驗(yàn)選用Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×3.0 mm，2.7 μm)反相色譜柱，短柱可以有效減少分析時(shí)間.

圖6　100%甲醇分離甾醇衍生物的色譜圖Fig.6　Chromatograms separated phytosterol derivatives by 100% methanol

圖7　標(biāo)準(zhǔn)甾醇衍生物的SRM圖Fig.7　SRM chromatograms of standard phytosterol derivatives

2.2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

在ESI源條件下，分別對待測甾醇標(biāo)準(zhǔn)衍生物做正、負(fù)離子模式下的全掃描分析，結(jié)果表明，各甾醇衍生物的最佳準(zhǔn)分子離子峰均在正離子模式下產(chǎn)生. 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對母離子優(yōu)化至最大響應(yīng)，然后對相應(yīng)子離子作全掃描分析，通過對碰撞能量的優(yōu)化，使子離子豐度達(dá)到最優(yōu). 將二級質(zhì)譜子離子峰作為最終定性定量的特征離子. 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1所列.

2.3方法比較

由于甾醇類物質(zhì)屬于極性很弱的化合物，直接進(jìn)質(zhì)譜幾乎不離子化，因此在這種情況下對其進(jìn)行定性定量分析就變得毫無意義. 文獻(xiàn)報(bào)道對甾醇類物質(zhì)的分析多采用高效液相色譜法[20]. 該法要求組分全部出峰，對于成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物的分析不但浪費(fèi)時(shí)間，而且定性不準(zhǔn). 取甾醇標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列濃度的工作溶液進(jìn)高效液相色譜分析，做系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所列. 本試驗(yàn)中LODs(信噪比S/N=3)在5～100 ng/mL之間， LOQs(S/N=10)在16.7 ～ 333 ng/mL 之間. 柱前衍生化HPLC-ESI-MS/MS法與高效液相色譜法相比較，4種植物甾醇測定的靈敏度提高了25～500倍.

表1　甾醇質(zhì)譜分析參數(shù)

表2　柱前衍生化HPLC-ESI-MS/MS法與高效液相色譜法比較

2.4標(biāo)準(zhǔn)植物甾醇衍生物的液質(zhì)分析

按照前述植物甾醇衍生過程將標(biāo)準(zhǔn)品衍生化反應(yīng)后，采用甲醇-水(體積比為99∶1)在25 min 內(nèi)對5種甾醇衍生物作二級質(zhì)譜的定性定量分析. 由于丹磺酰肼的衍生化產(chǎn)物存在同分異構(gòu)現(xiàn)象(順式和反式)，因此二級質(zhì)譜顯示為雙峰，如圖7所示.

每一種甾醇衍生物母離子都會在一定的碰撞能量下產(chǎn)生對應(yīng)的子離子峰，因此使用特定的子離子[M-C12H12NO2S]+作為對植物甾醇衍生物HPLC /SRM/MS 分析的特征離子. 結(jié)果表明：靈敏度和選擇性大大提高，定性更準(zhǔn)確. 各組分經(jīng)液相色譜分離，質(zhì)譜定性定量分析鑒定，如衍生后的麥角甾醇的準(zhǔn)分子離子峰為640，使用能量碰撞誘導(dǎo)解離，得到406，即化合物相應(yīng)的二級質(zhì)譜子離子峰，其質(zhì)譜圖如圖8所示.

圖8　麥角甾醇衍生物的質(zhì)譜圖和碰撞誘導(dǎo)解離機(jī)理Fig.8　Typical product ion spectra from CID of [M]+ion for Ergosterol derivative and collision induced dissociation mechanism

2.5線性方程、檢出限、定量限

將植物甾醇按1.3節(jié)所述衍生方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在同樣的液質(zhì)條件下，分別進(jìn)樣分析. 以甾醇衍生物質(zhì)量濃度(ρ，μg /mL) 為橫坐標(biāo)，衍生物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Yi/YI) 為縱坐標(biāo)，做線性回歸分析. 植物甾醇衍生物在總進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.05～100 μg /mL 時(shí)表現(xiàn)出較好的線性，相關(guān)系數(shù)在0. 990 3以上. 以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(LODs)，10倍信噪比(S/N= 10)計(jì)算定量限LOQ，確定本試驗(yàn)的LODs在0.2～20 ng /mL之間，LOQs在0.667～66.7 ng/mL之間. 為考察方法重現(xiàn)性，分別對甾醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行日內(nèi)和日間衍生化反應(yīng)，最后進(jìn)樣分析，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.0%，表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性. 試驗(yàn)結(jié)果如表3、4所列.

表3　甾醇衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

表4　植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品3種質(zhì)量濃度日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6加標(biāo)回收率

為考察該方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗(yàn). 稱取18 份等量的羊棲菜粉末，分3組，進(jìn)行高、中、低水平的加標(biāo)試驗(yàn)，經(jīng)提取、皂化、衍生化反應(yīng)后，采用同樣的液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)行測定. 計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD) ，得回收率在82.0% ～107.5%之間，精密度均小于2.0%，結(jié)果如表5所列.

表5　高、中、低3種質(zhì)量濃度下的加標(biāo)回收率

2.7實(shí)際樣品測定

將海帶、紫菜樣品按1. 6 節(jié)冷凍干燥、粉碎過篩、提取、皂化，按1. 4 節(jié)衍生，平行做6個(gè)樣，在1.2節(jié)的液質(zhì)條件下進(jìn)樣分析3次. 以甾醇標(biāo)準(zhǔn)品衍生物二級質(zhì)譜子離子的色譜保留時(shí)間做對照，判斷海帶、紫菜樣品中植物甾醇的種類，羊棲菜、海帶、紫菜中甾醇平均含量如表6所列. 由表6可知，巖藻甾醇在羊棲菜中含量最多，麥角甾醇、豆甾醇幾乎不含，紫菜中這幾種甾醇含量最少. 這也說明豆甾醇多存在谷物作物、植物油等物質(zhì)中，藻類物質(zhì)含量較少甚至沒有. 故在羊棲菜、紫菜、海帶研究中，羊棲菜的研究意義更大.

表6　海藻中甾醇的平均含量(n=6)

注：“Nd”為未檢出.

3　結(jié)論

本試驗(yàn)選用溫和的高碘氧化試劑DMP將植物甾醇氧化成酮，以丹磺酰肼作為柱前衍生化試劑，膽固醇為內(nèi)標(biāo)物，采用HPLC-ESI-MS/MS法測定了羊棲菜、海帶、紫菜中的植物甾醇. 結(jié)果表明，羊棲菜中含有巖藻甾醇、β-谷甾醇及少量的麥角甾醇，其中巖藻甾醇含量最高；紫菜、海帶中植物甾醇種類同羊棲菜類似，但是每種甾醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于羊棲菜，故研究羊棲菜具有很大意義. 由于該方法采用丹磺酰肼作為柱前衍生化試劑，丹磺酰肼的叔氮極易離子化，大大增強(qiáng)了質(zhì)譜信號，與高效液相色譜法相比，4種植物甾醇的測定靈敏度提高了25～500倍. 同時(shí)該方法還具有衍生化條件溫和、產(chǎn)物無毒、靈敏度高、重現(xiàn)性良好等特點(diǎn)，為各類谷物、植物性食物、植物油等的分析研究提供參考依據(jù).

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A Highly Sensitive Method for Quantitative Analysis of Phytosterols by HPLC-MS/MS with Pre-Column Derivatization

SUN Qi, CHEN Fan

(CollegeofChemistryandMaterials，WenzhouUniversity，Wenzhou325035，ZhejiangChina)

A sensitive liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) method for the determination of phytosterols in sargassum fusiforme has been developed and validated. Four kinds of phytosterols were derivatived by dansyl hydrazine and separated on a reversed-phase Agilent Poroshell 120 EC-C18 column(50 mm×3.0 mm, 2.7 μm) with a mobile phase of methanol-water (99∶1,V∶V) at a flow rate of 0.3 mL/min, and the injection volume was 10 μL. An electrospray ionization source was applied and operated in the positive ion mode, confirmed by the selected reaction monitoring (SRM) mode using an internal standard method．Phytosterols showed a wide linearity in 0.05～100 μg/mL, with correlation coefficients between 0.990 3 and 0.998 1.The limits of detection of phytosterols were between 0.2 and 20 ng/mL. This simple, selective and sensitive method can be successfully used for the determinations of different types of matrices, and has a 25～500 fold increase in sensitivity than that in high performance liquid chromatography.

phytosterols；high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry；pre-column derivatization；select reaction monitoring

2016-07-25;

2016-09-12.

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目( 21272178) 資助，F(xiàn)oundation item:NSFC(NO.21272178)

孫琪(1992-)，女，碩士研究生，主要從事色質(zhì)聯(lián)用分析，Tel：15088919488,E-mail: 15088919488@163.com

陳帆，教授，主要從事色質(zhì)聯(lián)用分析，Tel：13906648148,E-mail: fanchen@wzu.edu.cn.

O657.3

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1006-3757(2016)03-0169-10

10.16495/j.1006-3757.2016.03.008