馬心慧，付　瑜，曹淑杰，王雙力，武偉晶,王軍利，王　芳

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重度抑郁障礙與腫瘤壞死因子ɑ和白細(xì)胞介素6基因啟動子區(qū)多態(tài)性的相關(guān)性

馬心慧1，付瑜1，曹淑杰2，王雙力1，武偉晶1,王軍利1，王芳1

目的探討腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)基因啟動子區(qū)-308G/A、-857C/T位點(diǎn)，白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)基因啟動子-174G/C和-572C/G多態(tài)性與重度抑郁障礙癥發(fā)生的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法檢測393例重度抑郁障礙癥患者和393名健康者對照各個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果TNF-α基因啟動子-857C/T位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布在重度抑郁障礙癥組與正常對照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，-857T的等位基因頻率只在男性重度抑郁障礙癥組與對照組間存在顯著差異(OR=0.309,95%CI:0.218～0.439,P<0.01)，而-308A位點(diǎn)的等位基因頻率只在女性病例組與對照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(OR=0.399,95%CI:0.246～0.648,P<0.01)。結(jié)論證實(shí)TNF-α基因啟動子區(qū)多態(tài)性可能是中國北方漢族重度抑郁障礙患者的風(fēng)險(xiǎn)因素。TNF-α基因啟動子區(qū)多態(tài)性可能與重度抑郁障礙的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。

重度抑郁障礙癥；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6；遺傳多態(tài)性

近年來，對重癥抑郁障礙癥的研究主要是對可能的致病因素的研究。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞因子可能參與了重癥抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展[1，2]。本研究從分子生物學(xué)水平探索腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)基因啟動子區(qū)-857C/T、-308G/A和白細(xì)胞介素6(inter leukin-6,IL-6)基因啟動子區(qū)-174G/C和-572C/G位點(diǎn)基因的多態(tài)性，及其與重度抑郁障礙發(fā)病的關(guān)聯(lián)性，為重度抑郁障礙的防治提供理論依據(jù)。

1　對象與方法

1.1對象病例組：選取2014-01至2015-02黑龍江省哈爾濱市第一專科醫(yī)院門診及住院患者共393例，其中男232例，女161例，平均(39.19±9.44)歲，均為漢族；對照組：共393例，選取同期武警黑龍江總隊(duì)醫(yī)院體檢中心健康體檢者及志愿者，均為漢族。其中男211例，女182例；平均(30.75±4.94)歲。性別、年齡與病例組具有可比性。

1.2方法按HAMD-17[3]對抑郁癥狀嚴(yán)重程度做評估。對合格的入組人員征得同意后，完成HAMD-17量表和基本信息調(diào)查表。 運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測兩個基因上的4個位點(diǎn)。采集患者靜脈血5 ml于EDTA抗凝管充分混勻，分裝。PCR擴(kuò)增采用12 μl反應(yīng)體系，含50～200 ng基因組DNA，2×PCR緩沖液，15 mmol/L MgCl20.5 μl，5 μmol/L引物各0.5 μl，0.5 UTaq酶0.5 μl(北京天根)。取20 μlPCR產(chǎn)物，建立總體積為20 μl的酶切反應(yīng)體系，加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(NEB，北京)，37 ℃溫育過夜，4 ℃水浴15 min終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳分離，經(jīng)凝膠成像儀系統(tǒng)(Bio-RadgelDoc 2000，美國)處理后進(jìn)行基因型判讀，記錄并保存結(jié)果。TNF-α基因-308 G/A和-857 C/T的引物參照文獻(xiàn)[4]，IL-6基因-174 G/C和-572 C/G位點(diǎn)的引物參照文獻(xiàn)[5]。所有位點(diǎn)的引物、產(chǎn)物長度、PCR反應(yīng)退火溫度和酶切片段見表1。

表1　TNF-α和IL-6基因擴(kuò)增位點(diǎn)的引物序列、退火溫度及酶切片段

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理病例組和對照組間基因型和等位基因頻率的計(jì)算采用直接計(jì)數(shù)法。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，組間基因型頻率及等位基因頻率的差異性比較采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)　　果

經(jīng)分析TNF-α的-857 C/T、-308 G/A位點(diǎn)及IL-6的-174 G/C、-572 C/G位點(diǎn)，各多態(tài)性位點(diǎn)在對照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，且兩組人群性別和年齡均匹配。TNF-α-857 C/T、-308 G/A及IL-6-174 G/C、-572 C/G 4個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率分布(表2、3)。

表2　TNF-α基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和基因頻率在兩組男性、女性病例中的分布

表3　IL-6基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和基因頻率在兩組男性、女性病例中的分布

統(tǒng)計(jì)分析顯示，TNF-α基因啟動區(qū)-857C/T與-308G/A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在病例組及對照組間存在顯著差異。男性TNF-α基因啟動區(qū)-857T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例組及對照組間存在顯著差異(OR=0.309,95%CI:0.218～0.439,P<0.01)。而-308A位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在女性病例組及對照組間存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.399,95%CI:0.246～0.648,P<0.01)。而IL-6基因啟動區(qū)-174G/C與-572 C/G位點(diǎn)，男性、女性病例組基因型和等位基因頻率與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

連鎖不平衡程度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組的4個多態(tài)性位點(diǎn)之間呈明顯連鎖不平衡現(xiàn)象。單體型關(guān)聯(lián)分析顯示，所有單體型在兩組之間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討　　論

抑郁癥是一個全球性的精神問題，具有較高的患病率、復(fù)發(fā)率、病死率、致殘率。在我國已有超過2600萬的人患有抑郁癥，有10%～15%的抑郁癥患者死于自殺[6]。因此，多角度闡明抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在抗抑郁靶點(diǎn)，對開發(fā)新的、更有效、更特異的抗抑郁藥物，具有重要的理論價值和現(xiàn)實(shí)意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者治療前血清lL-17、IL-6、TNF-α、IL-1濃度高于治療后，也高于對照組，對應(yīng)指標(biāo)血清濃度與HAMD評分呈正相關(guān)[7，8]。而且人類長期暴露于炎性反應(yīng)因子可導(dǎo)致顯著的行為改變，如在人體中應(yīng)用免疫炎性反應(yīng)因子,腫瘤壞死因子(TNF-α)，IL-1，IL-6或者相應(yīng)制劑(如脂多糖或傷寒菌苗接種)可刺激機(jī)體出現(xiàn)先天性免疫炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)抑郁樣癥狀的產(chǎn)生[9]。TNF是一種與細(xì)胞死亡有關(guān)的細(xì)胞因子，而且TNF-α可能與突觸的可塑性，及人類的學(xué)習(xí)和認(rèn)知有關(guān)[10]。另一項(xiàng)尸檢研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者TNF-α水平較正常對照的前額葉皮質(zhì)模型高[11]。上述研究結(jié)果說明了抑郁癥患者存在免疫功能紊亂。近年來大量的研究也證實(shí)了遺傳學(xué)在抑郁癥的致病因素中發(fā)揮一定的作用，與抑郁癥有關(guān)的免疫遺傳學(xué)已發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)胞因子的多態(tài)性(如編碼IL-1,TNF-α的基因)可能使個體更易發(fā)展成抑郁癥[12]。

本研究中筆者未能發(fā)現(xiàn)TNF-α-308G/A多態(tài)性與重度抑郁障礙癥的易感性相關(guān)。可能的原因有：(1)種族和群體的差異；(2)樣本具有表型異質(zhì)性；(3)重度抑郁障礙癥可能是一種多因素疾病，TNF-α-308G/A多態(tài)性可能只發(fā)揮相對較小的作用；(4)可能還有其他TNF-α基因變異參與了重度抑郁障礙癥的病理生理過程，筆者發(fā)現(xiàn)-857C/T位點(diǎn)與重度抑郁障礙癥存在關(guān)聯(lián)恰恰證明了這一點(diǎn)。據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)來看，關(guān)于-857C/T與重度抑郁障礙關(guān)聯(lián)性的報(bào)道尚屬首次。

目前，國內(nèi)外IL-6基因與精神神經(jīng)類疾病的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道不多。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)-174G/C與-572C/G基因多態(tài)性與重度抑郁障礙存在關(guān)聯(lián)。分析其原因可能有：(1)由于基因多態(tài)性存在明顯的種族和地域差異，這種差異有可能導(dǎo)致同一種突變在不同的人群產(chǎn)生不同的表型效應(yīng)，各個研究結(jié)果的不一致；(2)在IL-6啟動子區(qū)域，可能存在其他多態(tài)位點(diǎn)，參與IL-6表達(dá)的復(fù)雜調(diào)控。

綜上所述，本研究表明TNF-α基因啟動區(qū)-857 C/T位點(diǎn)可能與中國北方漢族重度抑郁障礙患者的發(fā)病存在關(guān)系，其中-857T與-308A可能是其易感基因。后期筆者將加大樣本量進(jìn)行研究。再通過體內(nèi)和體外研究將基因多態(tài)性與mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)聯(lián)系起來，以揭示基因變異對表達(dá)水平產(chǎn)生的影響。

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(2015-05-25收稿2015-12-15修回)

(責(zé)任編輯岳建華)

Association of polymorphisms in promoter region of tumor necrosis factor and interleukin 6 gene with major depressive disorder

MA Xinhui1，F(xiàn)U Yu1，CAO Shujie2，WANG Shuangli1,WU Weijing1,WANG Junli1, and WANG Fang1.

1.Department of Clinical Laboratory，Heilongjiang Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Harbin 150076, China；2. Department of Clinical Laboratory，The First Specialist Hospital of Harbin in Heilongjiang Province,Harbin 150001, China

ObjectiveTo investigate the relationship between the -308G/A and -857C/T of tumor necrosis factorαgene(TNF-α)，-174G/C and-572C/G of interleukin-6 gene(IL-6)polymorphisms and major depressive disorder.MethodsGenomic DNA was isolated from the venous blood leukocytes of 393 unrelated patients with major depressive disorder and 393 healthy unrelated individuals(control group).All of the polymorphisms were genotyped by PCR-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP).Genotype and allele frequencies were analyzed using SPSS 13.0 software. ResultsThere were significant differences in both allele and genotype frequencies of -857C/T of TNF-αgene between the major depressive disorder and control groups(P<0.05).The allele T of -857 T in male major depressive disorder group was significantly higher than that in contol group(OR=0.309,95%CI:0.218-0.439,P<0.01) The allele A of -308 A in female major depressive disorder group was significantly higher than that in contol group (OR=0.399,95%CI:0.246-0.648,P<0.01). ConclusionsThis study confirm that TNF-α gene promoter region gene polymorphism may be risk factors for severe depressive disorder in North China Han.TNF-α gene promoter polymorphism may be associated with the onset of severe depressive disorder.

major depressive disorder；tumor necrosis factor；interleukin-6；genetic polymorphism

馬心慧，碩士，副主任技師。

1.150076哈爾濱，武警黑龍江總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.150001，黑龍江省哈爾濱市第一?？漆t(yī)院檢驗(yàn)科

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