王松 LIKe 崔鶴 王境堂 趙鑫鵬 苗鈞魁 劉小芳 趙憲勇 冷凱良

摘要：南極磷蝦油富含Omega3磷脂而具有強(qiáng)大的保健功能， 但由于其砷含量較高，在保健品領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制。由于南極磷蝦油中含有大量的磷脂質(zhì)，采用常規(guī)的提取方法分析難以對(duì)其砷形態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。本研究采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（（HPLCICPMS）聯(lián)用技術(shù)建立了針對(duì)砷甜菜堿（AsB）、二甲基砷酸（DMA）、一甲基砷酸（MMA）、三價(jià)砷As、五價(jià)砷As5種砷形態(tài)的分析方法。采用C18固相萃取進(jìn)行樣品脫脂前處理，采用陰離子交換色譜IonPac AS9H陰離子分析柱（250 mm×4 mm），流動(dòng)相采用38 mmol/L Na2SO4 +15 mmol/L乙酸鈉；流速0.6 mL/min，流速1 mL/min，進(jìn)行5種形態(tài)砷化合物的分析。結(jié)果表明，5種砷化合物的線性范圍為0.5～500 μg/L，相關(guān)系數(shù)R>0.9993. 檢出限（LOD）為 0.1～0.2 μg/L，定量限（LOQ）為1.5～2.6 μg/L，RSD<5%。加標(biāo)回收率為88.9%～106.3%。樣品的測(cè)定結(jié)果顯示，南極磷蝦油中砷形態(tài)的主要存在形式為無毒的砷甜菜堿，因此可以安全地應(yīng)用于食品及保健品。

關(guān)鍵詞 ：南極磷蝦油； 砷； 形態(tài)分析； 高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜

1 引 言

南極磷蝦已成為世界遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)最重要的漁業(yè)資源[1，2]。南極磷蝦中總脂肪含量豐富，約占鮮重的3%，從南極磷蝦中提取的南極磷蝦油含有豐富的Omega3（ω3）多不飽和脂肪酸磷脂質(zhì)以及蝦青素等生物活性脂質(zhì)[3]。研究表明，南極磷蝦油具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血脂、健腦益智等多種功能，南極磷蝦油已經(jīng)在食品、保健品等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[4～10]。

在南極磷蝦作為重要的生物資源受到普遍重視的同時(shí)，其相關(guān)產(chǎn)品的食用安全性，特別是其中所含有毒重金屬含量備受關(guān)注。自然界的砷元素存在于沉積巖和熔積巖中，主要經(jīng)過地表徑流等途徑進(jìn)入到海水中，又通過食物鏈在海產(chǎn)生物體內(nèi)富集，特別是以水體中浮游生物為食物鏈的生物體內(nèi)的富集傾向更明顯，致使海洋生物中含有較多的砷[11]。海產(chǎn)品中砷的存在有很多種化學(xué)形態(tài)，包括無機(jī)砷和有機(jī)砷。其中無機(jī)砷包括三價(jià)的亞砷酸鹽（As）和五價(jià)的砷酸鹽（As）；檢測(cè)到的有機(jī)砷形態(tài)包括一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷膽堿（AsC）、砷甜菜堿（AsB）、砷糖及砷脂等[12]。砷元素的毒性與其存在形態(tài)密切相關(guān)，無機(jī)砷具有致癌毒性，有機(jī)砷通常被認(rèn)為是低毒或無毒的。以砷化合物的半致死量LD50計(jì)，其毒性從大到小依次為As>As>MMA>DMA>AsC>AsB[13]。研究表明，海產(chǎn)品中雖然砷含量較高，但主要是以無毒的有機(jī)砷形態(tài)存在，在海洋動(dòng)物（如蝦、蟹）中最主要的砷形態(tài)是砷甜菜堿[13]。因此，在測(cè)定海產(chǎn)品中砷的含量時(shí)，進(jìn)行砷的形態(tài)分析十分必要。對(duì)砷形態(tài)采用不同的毒性綜合評(píng)價(jià)，比單純用砷的總量評(píng)價(jià)海產(chǎn)品安全性更具科學(xué)性。

南極磷蝦油中具有較高的總砷含量，使人們對(duì)其食用安全性產(chǎn)生一定疑慮，因此有必要建立準(zhǔn)確、高效的南極磷蝦油砷形態(tài)分析檢測(cè)方法，進(jìn)行南極磷蝦油中砷元素的安全性評(píng)價(jià)。目前，針對(duì)食品中的砷形態(tài)分析研究已多有報(bào)道，由于多數(shù)砷化合物（如砷甜菜堿等）為水溶性化合物，因此樣品大多可采用酸溶液或甲醇/水等極性溶劑進(jìn)行直接提取，提取液經(jīng)過濾后進(jìn)行HPLCICPMS檢測(cè)[12，14～17]。目前，針對(duì)南極磷蝦以及魚油等產(chǎn)品的砷元素分析已有相關(guān)研究報(bào)道[18，19]，但針對(duì)南極磷蝦油樣品的砷元素形態(tài)分析尚未見報(bào)道，使得南極磷蝦油砷元素的安全性評(píng)價(jià)缺少必要的數(shù)據(jù)依據(jù)。南極磷蝦油中砷形態(tài)分析的主要難點(diǎn)在于其主要成分與魚油等油脂類樣品存在較大差異。魚油中主要成分為甘油酯等低極性脂，可以直接采用極性溶劑進(jìn)行提取。南極磷蝦油中除甘油脂外，還含有大量磷脂等極性脂，采用甲醇/水等極性溶劑的提取過程中會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響提取效率和檢測(cè)精確度，因此樣品前處理對(duì)分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性具有較大影響。本研究主要根據(jù)砷甜菜堿等5種形態(tài)砷化合物與南極磷蝦油中脂質(zhì)的極性差異，采用固相萃取方法對(duì)南極磷蝦油樣品進(jìn)行脫脂處理，實(shí)現(xiàn)南極磷蝦油中砷化合物的有效提取。采用HPLCICPMs法進(jìn)行砷形態(tài)分析，實(shí)現(xiàn)了南極磷蝦油中5種形態(tài)砷含量的準(zhǔn)確檢測(cè)，為南極磷蝦油的食用安全性評(píng)價(jià)提供可靠了科學(xué)依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

CIC160型離子色譜儀（德國(guó)戴安公司），配有自動(dòng)進(jìn)樣器； 8800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；IonPac AS19陽(yáng)離子分析柱（250 mm×4 mm）；MilliQ超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；MS 3basic（IKA）混旋儀數(shù)控超聲清洗器；高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）。C18固相萃取柱（1000 mg，美國(guó)Agilent公司）。

砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （GBW08667）、亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08666）、一甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08668）、二甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08669）、砷甜菜堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08670）均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；質(zhì)譜調(diào)諧液（Ce，Co，Li，Mg，Tl，Y，質(zhì)量濃度為1 μg/L，美國(guó)Agilent公司），內(nèi)標(biāo)溶液：Sc， Ge， In， Bi，質(zhì)量濃度為10 mg/L，使用前用1% HNO3稀釋至1 mg/L。超純水（電阻率18.2 MΩ cm）；NH4H2PO4、無水乙酸鈉、KNO3、乙二胺四乙酸二鈉、冰乙酸、無水乙醇、NaOH為優(yōu)級(jí)純。冰凍南極磷蝦購(gòu)自遠(yuǎn)洋漁業(yè)公司，以鮮南極磷蝦為原料，采用95%乙醇為提取劑，料液比1∶8，在40℃下振蕩提取多次，合并提取液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶，獲得南極磷蝦油樣品。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 總砷測(cè)定

稱取0.5 g樣品于聚四氟乙烯離心管中，加入3 mL HNO3和1 mL H2O2，擰松離心管帽于750 W微波消解3～4 min。重復(fù)兩次，每次間隔冷卻10 min，清澈的樣品液用去離子水定容至10 mL， 用于總砷檢測(cè)[15]。

2.2.2 砷形態(tài)測(cè)定

（1） 樣品前處理 稱取南極磷蝦油樣品約2.5 g于15 mL離心管中，于5 mL 90%甲醇中超聲溶解，于4℃靜置5 min后，取上清液0.5 mL，經(jīng)過SepPak C18柱（1000 mg），以50%甲醇為洗脫液進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮，以超純水定容至5 mL，8000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。（2）ICPMS工作條件 掃描類型串接，等離子體模式為高靈敏度模式，分析模式為He模式，RF入射功率1600 W，載氣為高純氬氣，采樣深度10.0 mm，載氣流速0.34 L/min，碰撞池氦氣流量4.3 mL/min，霧化室溫度2℃，射頻電壓1.68 V，蠕動(dòng)泵泵速30 r/min，選擇He為反應(yīng)氣，檢測(cè)質(zhì)量數(shù)為m/z 75（As）。（3）離子色譜條件 IonPac AS9H陰離子分析柱（250 mm×4 mm），IonPac AG9HC陰離子保護(hù)柱（50 mm×4 mm）；ASRS 300陰離子抑制器（4mm）；流動(dòng)相： 38 mmol/L Na2CO315 mmol/L 乙酸鈉； 流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量100 μL； 流速1 mL/min； 柱溫21℃ ； 進(jìn)樣體積25 μL。 與標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間對(duì)照對(duì)砷的化合物進(jìn)行定性分析。 本方法以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)南極磷蝦萃取物以及南極磷蝦油中的砷的化合物進(jìn)行定性分析， 以標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)不同形態(tài)的砷進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 總砷的測(cè)定

對(duì)南極磷蝦整蝦和南極磷蝦油樣品進(jìn)行總砷含量的測(cè)定。南極磷蝦整蝦樣品的總砷含量（以干重計(jì)）為（2.031±0.021） mg/kg。南極磷蝦油是以解凍南極磷蝦為原料，以95%乙醇提取獲得，蝦油提取率約為3.2%（南極磷蝦含水率為81.2%），其總砷濃度達(dá)到（8.334±0.019） mg/kg。由此可知，南極磷蝦中大部分的砷化合物在萃取過程中遷移到蝦油中。

3.2 南極磷蝦油中砷化合物形態(tài)分析

3.2.1 南極磷蝦油前處理?xiàng)l件的選擇 南極磷蝦油主要成分是甘油酯、磷脂以及蝦青素酯。大量脂類物質(zhì)的存在會(huì)造成儀器污染，干擾檢測(cè)結(jié)果，影響回收率，因此，去除脂肪是南極磷蝦油中的砷化合物的檢測(cè)前處理的關(guān)鍵步驟。

由于AsB等5種砷化合物均為極性化合物，在C18柱上吸附率很低，因此參考Moll等采用的SepPak C18固相萃取法[12]，可以有效地去除脂類基質(zhì)，達(dá)到理想的油脂凈化效果。本實(shí)驗(yàn)以5種砷化合物中與C18吸附性最強(qiáng)的AsB為研究對(duì)象，以50%甲醇溶液為洗脫劑。由圖1可知，隨著洗脫劑用量增大，AsB回收率提高，當(dāng)洗脫體積達(dá)到30 mL時(shí)，AsB回收率達(dá)到95.3%，繼續(xù)增大洗脫劑用量，AsB回收率不再有明顯上升，說明采用30 mL 以上體積洗脫劑可以實(shí)現(xiàn)AsB的理想回收。從脫脂效率結(jié)果可知，當(dāng)洗脫劑用量小于30 mL時(shí)，油脂脫除率接近100%，繼續(xù)增大洗脫劑用量，油脂脫除率逐漸下降。綜合考慮回收率和脫脂效率，最終確定采用30 mL 50%甲醇溶液進(jìn)行洗脫。

3.2.2 色譜分離條件的選擇 由于AsB在水溶液中為陽(yáng)離子化合物，

圖2 陰離子交換柱HPLCICPMS 5種形態(tài)砷化合物色譜圖

Fig.2 Chromatogram of five species of arsenic analytes by anionexchange LCICPMSDMA， MMA， As和As均為陰離子化合物，因此參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用陰離子交換色譜HPLCICPMS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行多種砷形態(tài)的分離分析。選擇Na2CO3、乙酸鈉溶液為流動(dòng)相，對(duì)色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)Na2CO3濃度為38 mmol/L 和乙酸鈉濃度15 mmol/L，pH 10.5時(shí)，5種砷形態(tài)化合物可以在13 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。從圖2可見，5種砷化合物出峰順序依次是AsB， DMA， As， MMA和As。

3.2.3 方法線性范圍與檢出限

分別配制0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0， 100.0， 200.0和500.0 μg/L 系列砷化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析。5種砷化合物的線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)≥0.9999，檢出限（S/N=3）為0.1～0.2 μg/L，定量限（S/N=10）為1.5～2.6 μg/L （表1）。在常規(guī)工作中，根據(jù)實(shí)際樣品中各砷化合物的質(zhì)量濃度，校準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍通常選擇為0.5～500.0 μg/L。

3.3 南極磷蝦油5種砷形態(tài)測(cè)定

采用優(yōu)化的前處理?xiàng)l件和色譜條件進(jìn)行南極磷蝦油中砷形態(tài)的測(cè)定。分析結(jié)果的色譜圖如圖3所示，共檢出6種砷化合物，包括AsB， DMA， As， MMA， As及1種未知砷化合物。南極磷蝦油中砷化合物含量檢測(cè)結(jié)果如表3所示，其中含量最高的砷化合物AsB的濃度達(dá)到（7.322±0.021） mg/kg，占總砷含量的87.9%；其次是DMA （0.622±0.0015）mg/kg，MMA為（0.0182±0.0009）mg/kg。3種檢出的有機(jī)砷含量超過總砷含量的95.58%。無機(jī)砷As及As含量總計(jì)約為0.027 mg/kg， 僅約占南極磷蝦油中總砷含量的0.27%。研究表明，AsB幾乎存在于所有的海產(chǎn)品中，是海洋甲殼類和節(jié)肢動(dòng)物中最主要的砷賦存形態(tài)[19，20]。AsB的結(jié)構(gòu)類似于甜菜堿。其半致死量LD50>10000 mg/kg，通常認(rèn)為AsB是無毒的。同時(shí)AsB是穩(wěn)定性較好的化合物，其在人體中不能代謝，直接被排出體外，不會(huì)危害人體健康[21～23]。由此可知，南極磷蝦油中總砷含量雖然較高，但主要是實(shí)際無毒有機(jī)砷。因此，南極磷蝦油可以作為安全的食品或保健品原料予以廣泛應(yīng)用。

3.4 方法的加標(biāo)回收率

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，南極磷蝦油樣品中主要含有AsB和少量的DMA， 以及微量的MMA，As和As。選擇1份南極磷蝦油樣品，AsB和DMA含量分別為7.322和0.622 mg/kg，其余3種砷化合物含量均<0.02 mg/kg。 在樣品中分別按照3個(gè)不同水平加入混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行制備6份樣品，采用本方法檢測(cè)5種砷化合物，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種適合高磷脂含量油脂中不同形態(tài)的砷的提取凈化及檢測(cè)的方法。采用C18固相萃取凈化法，從南極磷蝦油中提取砷化合物，可以有效實(shí)現(xiàn)油脂的脫除，提高了南極磷蝦油中砷化合物的提取效率。采用HPLCCPMS分析檢測(cè)南極磷蝦油中5種砷形態(tài)，優(yōu)化了色譜分離條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 5種砷化合物可以在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。檢測(cè)方法的線性范圍為0.5～500 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.9993，檢出限為0.1～0.2 μg/L，定量限為1.5～2.6 μg/L，RSD均小于5%，加標(biāo)回收率為88.9%～106.3%。結(jié)果表明，本方法線性范圍寬、準(zhǔn)確性好、精密度高，樣品前處理方法簡(jiǎn)便，適用于南極磷蝦油中5種砷化合物形態(tài)的分析檢測(cè)。同時(shí)本研究方法可適用于其它磷脂含量較高的油脂類產(chǎn)品的砷化合物的檢測(cè)。

南極磷蝦油中檢測(cè)到的AsB， DMA和MMA等3種有機(jī)砷含量占南極磷蝦油總砷含量的95.58%，而毒性較高的As及As含量?jī)H約占南極磷蝦油中總砷含量的0.27%。由此可見，南極磷蝦油中總砷含量雖然較高，但主要是無毒的有機(jī)砷。因此，南極磷蝦油可以作為安全的食品或保健品原料予以使用。

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Abstract Arsenic is a toxic metalloid that is abundant in many marine species， including Antartic krill. Krill oil is being developed for the healthfood and dietary supplement because it possesses of omega3 fatty acids and phospholipidderived fatty acids； however， it was limited due to its multiple arsenic species residues. Here， we presented a high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometric （HPLCICPMS） method for the simultaneous， sensitive， and rapid quantification of five arsenic metabolites including organic and inorganic forms， then the method was applied to the analysis of arsenic species in krill oil. The analytes were separated on a hydroxideselective anionexchange column with sodium carbonate （38 mmol/L） and sodium acetate （15 mmol/L） as mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min for 15 min. Arsenic analytes were monitored with a triple quadrupole ICP mass spectrometer. Validation revealed that the method had a linear range from 0.5 to 500 μg/L with R>0.9993. The LOD was 0.1-0.2 μg/L and LOQ was 1.5-2.6 μg/L with RSD<5%. The standard addition method displayed a recovery range from 88.9% to 106.3%. Application of the method to arsenic species analysis in krill oil indicated that krill oil was a safe food or diet supplement.

Keywords Antartic krill oil； Arsenic； Speciation analysis； High performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry