張晶晶 康天放 魯理平 程水源

摘要：采用化學共沉淀法制備四氧化三鐵（Fe3O4）磁性納米粒子（MNPs），依次用3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）、丁二酸酐（SAH）對Fe3O4 MNPs表面進行修飾，得到羧基功能化的核殼型磁性納米粒子（Fe3O4@APTS·SAH MNPs），分別采用透射電鏡（TEM）、磁滯回線、X射線光電子能譜（XPS）和傅里葉紅外光譜（FTIR）對其進行了表征。將此納米粒子修飾在自制的磁性玻碳電極（MGCE）表面，用1（3二氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化納米粒子表面的羧基，通過與氨基的共價交聯，將抗微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（MCLR）抗體（antiMCLR）固定于該修飾電極上，用牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點，構建了一種檢測MCLR的電流型免疫傳感器。采用直接競爭免疫反應模式，在標記物辣根過氧化物酶（HRP）的MCLR（MCLRHRP）存在下，利用差分脈沖伏安法（DPV）測定溶液中的微囊藻毒素。在優(yōu)化的實驗條件下，免疫傳感器對MCLR的線性測定范圍為0.05～100 μg/L，檢出限為0.01 μg/L（S/N=3）。構建的免疫傳感器呈現出良好的重現性、穩(wěn)定性和特異性。將本傳感器用于實際水樣的測定，加標回收率為94.3%～99.5%。

關鍵詞 ：磁性納米粒子； 微囊藻毒素； 免疫傳感器； 差分脈沖伏安法

1 引 言

微囊藻毒素（MCs）是一種環(huán)狀七肽肝毒素，可破壞人體細胞內的蛋白磷酸化平衡，引起肝臟病變[1，2]。目前， 已發(fā)現80多種MCs的同分異構體[3]，其中微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（MCLR）是已發(fā)現的毒性最強的微囊藻毒素之一[4]。世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的《飲用水水質準則》[5]中規(guī)定MCLR限量值為1 μg/L，因此檢測飲用水源中的MCLR對于保障飲用水安全具有重要意義。目前，檢測MCLR 的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[6]、高效液相色譜質譜聯用技術（HPLCMS）[2，7]、蛋白磷酸酶抑制分析法（PPI）[8，9]等，HPLC和HPLCMS雖然靈敏度較高，但分析周期長、儀器設備昂貴、樣品前處理耗時，并且對操作人員技術要求較高；而PPI法檢測MCLR的選擇性不高。因此，研究開發(fā)用于水環(huán)境中藻毒素的簡單、快速、低成本的檢測技術具有重要的實際應用意義。

免疫傳感器是將傳感技術與特異性免疫反應相結合而建立的一類分析技術。應用電化學免疫傳感器檢測MCLR具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、易實現微型化等優(yōu)點，近年來備受關注[10～12]。磁性納米粒子（MNPs）是一種新型納米材料[13～15]，可以用多種物質對其表面修飾，以實現其表面的功能化[16，17]。在本研究組的前期工作中，利用戊二醛將氨基功能化的四氧化三鐵（Fe3O4）MNPs與MCLR抗體（antiMCLR）上的氨基交聯，構建了檢測MCLR的免疫傳感器[18]。

本研究采用3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）修飾Fe3O4磁性顆粒，得到Fe3O4@APTS，再利用丁二酸酐（SAH）將Fe3O4@APTS羧基化，得到Fe3O4@APTS·SAH，

通過磁力將復合物均勻地修飾到自制的磁性玻碳電極（MGCE）表面。利用1（3二氨基丙基）3乙基碳二亞胺（EDC）和N羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化磁性顆粒表面的羧基，將Fe3O4@APTS·SAH和antiMCLR抗體偶聯，基于直接競爭原理，構建了檢測MCLR的免疫傳感器。本免疫傳感器呈現出良好的重現性、穩(wěn)定性和特異性，用于實際水樣的測定，結果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI 650d電化學工作站（上海辰華儀器公司）；KQ218型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZHWY103B培養(yǎng)振蕩器（上海智成分析儀器制造有限公司）；JEM1200EX透射電子顯微鏡（TEM，日本電子公司）；7410VSM 振動樣品磁強計（美國Lake Shore公司）；X射線光電子能譜儀（日本ULVACPHI公司）。

石墨粉（320目，光譜純，國藥化學試劑有限公司）；環(huán)形釹鐵硼磁鐵（內徑1 mm，外徑5 mm，厚1 mm，北京豐瑞磁性材料中心）；玻碳片（直徑5 mm，厚度2 mm，天津艾達恒晟科技公司）；MCLR、antiMCLR、辣根過氧化物酶標記的MCLR（MCLRHRP）、微囊藻毒素精氨酸精氨酸（MCRR）和微囊藻毒素酪氨酸精氨酸（MCYR）（北京伊普瑞斯公司）；APTS和牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；其它試劑均為分析純；實驗用超純水由Advantage A10超純水系統(tǒng)（法國MilliQ公司）制備。

2.2 磁性免疫傳感器的制備與修飾

2.2.1 磁性玻碳電極的制備 參照文獻[18]中的方法制備MGCE（圖1A）。

2.2.2 羧基功能化Fe3O4納米粒子的制備 采用化學共沉淀方法制備Fe3O4 MNPs[19]。稱取25 mg Fe3O4 MNPs于5 mL乙醇溶液中，超聲分散1 h，向其中加入0.4 mL APTS，室溫下置于搖床中振搖24 h，磁分離，用乙醇和超純水分別清洗，制得核殼型納米粒子Fe3O4@APTS。將所制備的Fe3O4@APTS納米粒子分散于5 mL乙醇中，加入5 mL含有800 mg丁二酸酐（SAH）的二甲亞砜溶液，振搖反應24 h，磁分離，并用乙醇和超純水清洗后，以水定容至2.5 mL，于4℃儲存?zhèn)溆肹20]。圖1B為制備羧基功能化Fe3O4（Fe3O4@APTS·SAH）納米粒子的示意圖。

2.2.3 抗體在磁性電極表面的固定 磁性電極修飾過程如圖1C所示。將MGCE表面拋光，依次在水、無水乙醇、水中超聲處理3 min，電極表面滴加25 μL Fe3O4@APTS·SAH納米粒子懸濁液，室溫下晾干后，以水沖洗，得到Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。將其浸入含0.1 mol/L EDC和0.05 mol/L NHS混合溶液中，反應1 h后，滴加10 μL 15 μg/mL antiMCLR于MGCE表面，4℃下反應24 h，晾干后用水沖洗，得到antiMCLR/Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。電極表面滴加1% BSA，濕盒中反應1 h，水沖洗后，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MCLR的測定方法 電化學測定采用三電極系統(tǒng)：修飾的MGCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。將10.0 μL不同濃度的MCLR 標準溶液或水樣與10.0 μL 20 μg/mL MCLRHRP混合滴加到免疫傳感器表面，孵育40 min，水沖洗，得到MCLR（MCLRHRP）/antiMCLR/Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。在含2.4 mmol/L H2O2 和1.2 mmol/L 對苯二酚（HQ）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （PBS，pH 7.4）中，采用差分脈沖伏安法（DPV）測量響應電流。電位掃描范圍為 ，脈沖振幅50 mV，脈沖寬度50 ms。

3 結果與討論

3.1 磁性納米粒子的表征

從圖2A可見，Fe3O4 MNPs呈球形，分散均勻，粒徑約10～20 nm。Fe3O4和Fe3O4@APTS·SAH的矯頑力（圖2B）分別為9.1399和10.981 G，剩磁分別為1.1569和1.2128 emu/g，比飽和磁化強度十分接近，分別為65.029和64.119 emu/g，說明對Fe3O4進行表面羧基功能化后未對其磁學性能造成明顯影響。

Fe3O4納米粒子的X射線光電子能譜（XPS）分析全譜圖如圖3A所示，可見其主要組成元素為Fe與O，在材料表面的含量分別為65.89%和34.11%。圖3B中位于723.3和709.5 eV的特征峰為Fe 2p1/2和Fe 2p3/2，說明材料中有一定量的Fe和Fe。圖3C中位于528.8 eV的特征峰為O 1s，對應于Fe3O4中的O元素。圖3D所示的 Fe3O4@APTS·SAH全譜分析表明，其主要組成元素為O， C， Fe， Si和N，含量分別為46.55%， 28.21%， 19.93%， 2.95%和2.36%，相對于圖3A中元素組成和含量有明顯變化，其中C， Si， N元素分別來自于已連接到Fe3O4的APTS和SAH，圖3E～G中位于398.8， 284和101 eV的特征峰分別對應于N 1s， C 1s和Si 2p。

4 結 論

Fe3O4@APTS·SAH磁性納米材料具有良好的磁學性能和生物相容性，將其固載于磁性電極表面，采用直接競爭模式，構建了檢測MCLR的免疫傳感器。本方法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高等優(yōu)點，有望用于微囊藻毒素的現場快速測定。

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Abstract An immunosensor for detection of microcystin（leucinearginine） （MCLR） was constructed. Chemical coprecipitation method was used to synthesize ferriferrous oxide magnetic nanoparticles （Fe3O4 MNPs）. The Fe3O4 MNPs were modified with 3aminopropyltriethoxysilane （APTS） and succinic anhydride （SAH） in turn to generate carboxylfunctionalized coreshell MNPs （Fe3O4@APTS·SAH MNPs）， which were characterized by transmission electron microscope （TEM）， hysteresis loop， Xray photoelectron spectroscopy （XPS） and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， respectively. The Fe3O4@APTS·SAH MNPs were modified onto the surface of a homemade magnetic glassy carbon electrode （MGCE）. AntiMCLR antibody （antiMCLR） was immobilized on the modified MGCE by coupling reaction with ethyl3（dimethyl aminopropyl） carbodiimide （EDC） and Nhydroxysuccinimide （NHS）. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption sites of the electrode. Direct competitive immunoassay format was adopted. In the presence of horseradish peroxidaseconjugated MCLR （MCLRHRP）， MCLR in solution was determined by differential pulse voltammetry （DPV）. Under the optimized conditions， MCLR could be detected within a wide linear range of 0.05-100 μg/L with a detection limit of 0.01 μg/L （S/N=3）. Moreover， the immunosnssoe exhibited good reproducibility， stability and selectivity. The immunosensor was applied for the determination of MCLR in real water samples with the recoveries from 94.3% to 99.5%.

Keywords Magnetic nanoparticles； Microcystin； Immunosensor； Differential pulse voltammetry