李永青，焦 婷， 吳建平，權(quán)金強(qiáng)， 汪文強(qiáng)，鄭王山， 郭永博， 姚喜喜， 趙生國(guó)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

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禾本科8種牧草DNA條形碼通用序列篩選

李永青1，焦 婷2， 吳建平1，權(quán)金強(qiáng)1， 汪文強(qiáng)1，鄭王山1， 郭永博1， 姚喜喜1， 趙生國(guó)1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

DNA條形碼技術(shù)是利用DNA保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)。本研究根據(jù)GenBank中禾本科牧草matK和rbcL基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)4對(duì)通用引物，建立并優(yōu)化了針對(duì)禾本科7個(gè)主要牧草屬8種牧草11個(gè)樣品[高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)、玉米(Zeamays)、針茅(Stipacapillata)、“貝克”多年生黑麥草(Loliumperenne‘Plxie)、“凱帝莎”多年生黑麥草(L.perenne‘Caddieshack’)、甘肅羊茅(Festucakansuensis)、“百琪”紫羊茅(F.rubra‘Bargena’)、“夢(mèng)神”紫羊茅(F.rubra‘Maxima’)、“百勝”草地早熟禾(Poapratensis‘Barvictor’)、“鉆石”草地早熟禾(P.pratensis‘Diamond’)和芨芨草(Achnatherumsplendens)]的目的片段的擴(kuò)增條件。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和分析，經(jīng)分別比對(duì)，篩選出8種牧草的4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)5’端和3’端保守序列。對(duì)各標(biāo)記位點(diǎn)保守區(qū)內(nèi)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的單倍型分析。結(jié)果表明，matK1、matK2、matK3分別有6個(gè)單倍型(H1A、H1B、H1C、H1D、H1E和H1F)、7個(gè)單倍型(H2A、H2B、H2C、H2D、H2E、H2F和H2G)和3個(gè)單倍型(H3A、H3B和H3C)，rbcL基因有5個(gè)單倍型(H4A、H4B、H4C、H4D和H4E)。根據(jù)matK(matK1、matK2、matK3)和rbcL基因篩選的4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)為8種牧草建立了相對(duì)應(yīng)的特異DNA識(shí)別碼。本研究可為混合禾本科牧草飼料中的高粱屬、玉蜀黍?qū)?、芨芨草屬、針茅屬、黑麥草屬、羊茅屬和早熟禾屬?種牧草準(zhǔn)確識(shí)別提供分子水平上的科學(xué)依據(jù)。

單倍型組合；matK基因；rbcL基因；DNA條形碼；通用序列

DNA條形碼技術(shù)又稱(chēng)DNA條形編碼，因其快速、簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)等特點(diǎn)常被用作物種鑒定，其原理是基于物種種內(nèi)特異性和種間多樣性利用一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段(DNA barcode)構(gòu)建生物鑒別數(shù)據(jù)庫(kù)[1-2]。Hebert等[3]在對(duì)11種不同門(mén)的動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，COI(cytochrome coxi-dase subunit 1)基因序列的種間變異能夠較好地區(qū)分物種，而植物中的COI或其它線粒體基因的變異度較低，不適用于植物物種的鑒定。據(jù)報(bào)道，植物中的葉綠體基因雖相對(duì)保守，但其單親遺傳避免了基因重組，且含量豐富，擴(kuò)增能力強(qiáng)，故在葉綠體基礎(chǔ)上進(jìn)行植物物種的鑒定成為一種可行的辦法。國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組[4]建議將rbcL+matK組合作為陸地植物的核心DNA條形碼，用于構(gòu)建植物物種鑒定的統(tǒng)一框圖。我國(guó)植物條形碼研究團(tuán)隊(duì)基于更大規(guī)模取樣的比較分析，提出了將ITS或ITS2納入種子植物核心條形碼的建議[5-6]。Costion等[7]利用譜系多樣性指數(shù)識(shí)別熱帶雨林避難所和物種分化中心以確定生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)。基于ITS2序列，可以快速并有效地從豆蔻屬(Amomum)和山姜屬(Alpinia)中鑒別出中藥材[8]。

由于植物條形碼目前處于對(duì)片段的研究階段，其分析方法與動(dòng)物有所不同。首先進(jìn)行序列比對(duì)和人工校正，刪除位于序列兩端的不可靠堿基，利用PAUP或MEGA軟件，采用pairwise uncorrected p-distance[9]或Kimura-2-parameter distance(K2P)模型[10-11]計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離；采用分子系統(tǒng)學(xué)方法，通過(guò)構(gòu)建多種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)條形碼進(jìn)行分析(如NJ、UPGMA、ML和MP等)并檢驗(yàn)每個(gè)物種的單系情況。

禾本科牧草作為家畜日糧的主要飼草成分[12]，分布較廣，飼用意義較大的包括30屬[13]，大多為牲畜所喜食。然而DNA條形碼技術(shù)在牧草鑒別中應(yīng)用較為罕見(jiàn)，本研究借助分子遺傳學(xué)方法，嘗試建立禾本科7個(gè)屬8種牧草的DNA條碼，旨為進(jìn)一步開(kāi)展品種鑒別提供理論依據(jù)和方法參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品本研究共采集到禾本科牧草7個(gè)屬8個(gè)種共11個(gè)樣品，樣品信息詳見(jiàn)表1。

1.1.2PCR引物設(shè)計(jì)參照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中葉綠體matK和rbcL基因的核苷酸序列，采用Primers 5.0 (http://www.bbioo.com/download/58-166-1.html) 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其中，matK基因參照高粱屬(Sorghum)(AF164418、HF558520)、羊茅屬(Festuca)(DQ786940)、燕麥屬(Avena)(GU367310、GU367311)、大麥屬(Hordeum)(AB078131、AB078133)、稻屬(Oryza)(AF489915、AY768779)和針茅屬(Stipa)(KC129652、KC129653)設(shè)計(jì)3對(duì)引物；rbcL基因參照芨芨草屬(Achnatherum)(HQ600430)、針茅屬(HE573441)、高粱屬(HQ600085)和羊茅屬(FN668434、FN668435)設(shè)計(jì)1對(duì)引物(表2)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序稱(chēng)取植物葉片約10 mg，用液氮研磨至粉末后，采用CTAB法提取基因組DNA[14]，TE溶解。PCR擴(kuò)增采用50 μL體系：dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，10×Buffer 5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.4 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，加ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94 ℃變性40 s，退火30 s、72 ℃延伸30 s(30個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(30 min，150 V)檢驗(yàn)后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1　本研究所用樣品信息Table 1　Information of samples in this study

表2　引物PCR反應(yīng)最佳退火溫度表Table 2　The optimized annealing temperature of primer’s PCR reaction

1.2.2數(shù)據(jù)處理利用chromas 2.33(http://www.seekbio.com/DownloadShow.asp?id=284)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)和編輯，并利用MEGA 5.0(http://mega.software.informer.com/5.0/)進(jìn)行序列比對(duì)，同時(shí)借助Dnasp 5.10(http://www.itopdog.cn/soft/4785.html)分析單倍型和變異位點(diǎn)。

2　結(jié)果與分析

2.1引物篩選

根據(jù)本研究設(shè)計(jì)的4對(duì)通用引物，并針對(duì)禾本科11個(gè)牧草樣品建立并優(yōu)化目的片段PCR條件。

上述電泳檢測(cè)結(jié)果獲得的目的條帶清晰(圖1-4)，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，經(jīng)測(cè)序獲得較高質(zhì)量的核苷酸序列，說(shuō)明本研究篩選的引物可用于DNA條碼的篩選。

2.2DNA保守區(qū)識(shí)別

利用chromas 2.33對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)和編輯后，通過(guò)MEGA 5.0進(jìn)行序列比對(duì)，分別篩選標(biāo)記位點(diǎn)5’端和3’端高度保守區(qū)(表3)。

2.3單倍型分析

2.3.1matK1基于Dnasp 5.10進(jìn)行單倍型分析，8種牧草11個(gè)樣品彼此間有24個(gè)變異位點(diǎn)，分為6個(gè)單倍型(表4)。其中，H1A、H1B、H1D、H1E和H1F分別為高丹草、針茅、甘肅羊茅、多年生黑麥草和紫羊茅的特有單倍型；H1C為草地早熟禾、玉米和芨芨草的共享單倍型。另外，同一種牧草的不同品種間均具有共享單倍型(表4)。

圖1　引物F-M1/R-M433 PCR擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.1　Detection of primer F-M1/R-M433 PCR products in gel electrophoresis

注：M， Marker DL1000；1，高丹草；2，玉米；3，針茅；4，“貝克”多年生黑麥草；5，“凱帝莎”多年生黑麥草；6，甘肅羊茅；7，“百琪”紫羊茅；8，“夢(mèng)神”紫羊茅；9，“百勝”草地早熟禾；10，“鉆石”草地早熟禾；11，芨芨草。圖2同。

Note: M, Marker DL1000; 1,Sorghumbicolor×Sorghumsudanense; 2,Zeamays; 3,Stipacapillata; 4,Loliumperenne‘Plxie’; 5,Loliumperenne‘Caddieshack’; 6,Festucakansuensis; 7,Festucarubra‘Bargena’; 8,Festucarubra‘Maxima’; 9,Poapratensis‘Barvictor’; 10,Poapratensis‘Diamond’; 11,Achnatherumsplendens. The same in Fig.2.

圖2　引物F-M118/R-M434 PCR擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.2　Detection of primer F-M118/R-M434 PCR products in gel electrophoresis

2.3.2matK28種牧草11個(gè)樣品彼此間有8個(gè)變異位點(diǎn)，分為7個(gè)單倍型(表5)。H2A、H2C、H2D、H2E、H2F和H2G分別為玉米、針茅、高丹草、甘肅羊茅、多年生黑麥草和紫羊茅6種牧草的特有單倍型；H2B為牧草芨芨草和草地早熟禾的共享單倍型。另外，同一種牧草的不同品種間均具有共享單倍型。

2.3.3matK3在matK3片段上設(shè)計(jì)的引物未能成功擴(kuò)增出多年生黑麥草的兩個(gè)品種貝克和凱帝莎，擴(kuò)增得到9個(gè)樣品彼此間有5個(gè)變異位點(diǎn)，分為3個(gè)單倍型(表6)。其中，僅針茅有其特有單倍型H3B；H3A分別為甘肅羊茅、芨芨草、草地早熟禾和紫羊茅4種牧草的共享單倍型；H3C為高丹草和玉米的共享單倍型。

圖3　引物F-M1262/R-M1472擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.3　Detection of primer F-M1262/R-M1472 PCR products in gel electrophoresis

注：M， Marker DL500；1， 高丹草；2， 玉米；3， 針茅；4， “鉆石”草地早熟禾；5， “百勝”草地早熟禾；6， 甘肅羊茅；7， “百琪”紫羊茅；8， “夢(mèng)神”紫羊茅；9， “凱帝莎”多年生黑麥草(測(cè)序失敗)；10， “貝克”多年生黑麥草(測(cè)序失敗)；11， 芨芨草。

Note: M, Marker DL500; 1,Sorghumbicolor×Sorghumsudanense; 2,Zeamays; 3,Stipacapillata; 4,Poapratensis‘Diamond’; 5,Poapratensis‘Barvictor’; 6,Festucakansuensis; 7,Festucarubra‘Bargena’; 8,Festucarubra‘Maxima’; 9,Loliumperenne‘Caddieshack’(sequencing failure); 10,Loliumperenne‘Plxie’ (sequencing failure); 11,Achnatherumsplendens.

圖4　引物F-R1/R-R452擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.4　Detection of primer F-R1/R-R452 PCR products in gel electrophoresis

注：M， Marker DL1000；1， 高丹草；2， 玉米；3， 針茅；4， “貝克”多年生黑麥草；5， 芨芨草(測(cè)序失敗)；6， 甘肅羊茅；7， “百琪”紫羊茅；8， “夢(mèng)神”紫羊茅；9， “百勝”草地早熟禾；10， “鉆石”草地早熟禾；11， “凱帝莎”多年生黑麥草。

Note: M, Marker DL1000; 1,Sorghumbicolor×Sorghumsudanense; 2,Zeamays; 3,Stipacapillata; 4,Loliumperenne‘Plxie’; 5,Achnatherumsplendens(sequencing failure); 6,Festucakansuensis; 7,Festucarubra‘Bargena’; 8,Festucarubra‘Maxima’; 9,Poapratensis‘Barvicto’; 10,Poapratensis‘Diamond’; 11,Loliumperenne‘Caddieshack’.

表3　標(biāo)記位點(diǎn)保守區(qū)識(shí)別Table 3　Identification of conserved region in fragment marked

表4　matK1單倍型多態(tài)位點(diǎn)Table 4　matK1 haplotypes polymorphic sites

表5　matK2單倍型多態(tài)位點(diǎn)Table 5　matK2 haplotypes polymorphic sites

表6　matK3單倍型多態(tài)位點(diǎn)Table 6　matK3 haplotypes polymorphic sites

2.3.4rbcL序列在rbcL片段上設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增所得到的10個(gè)樣品中有33個(gè)變異位點(diǎn)，分為5個(gè)單倍型(表7)。其中，H4B、H4C和H4D分別為草地早熟禾、針茅和多年生黑麥草3種牧草的特有單倍型；H4A為高丹草和玉米的共享單倍型；H4E為紫羊茅和甘肅羊茅的共享單倍型。

2.4DNA Barcoding數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

基于matK3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(matK1、matK2、matK3)和rbcL基因在牧草種屬間表達(dá)的特異性建立了8種牧草的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)由matK3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)和rbcL基因的特異性引物(表2)、標(biāo)記位點(diǎn)5’端和3’端保守序列(表3)以及DNA識(shí)別碼(表8)共同組成。同一種牧草的不同品種，如草地早熟禾兩個(gè)品種鉆石和百勝具有共同的DNA barcoding，與其它屬的牧草DNA barcoding完全不同，驗(yàn)證了DNA條形碼種內(nèi)無(wú)差異、種間允許有較大差異的特征，達(dá)到了鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用Kimura2-parameter(K2P)模型[15]構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(matK1、matK2、matK3和rbcL)5’端和3’端保守序列按照首尾相接的方式組合而成，全長(zhǎng)為995 bp，8種牧草分列于不同的進(jìn)化支，而同一種牧草的不同品種聚在不同的進(jìn)化支上。

表7　rbcL單倍型多態(tài)位點(diǎn)Table 7　rbcL haplotypes polymorphic sites

表8　8種牧草的DNA Barcoding 數(shù)據(jù)庫(kù)Table 8　The Databas of DNA Barcoding for 8 species pasture

注： “M”代表“matK基因”，“R”代表“rbcL基因”，“H”代表“單倍型”，其后的“1、2和3”分別代表“matK1、matK2和matK3”3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，“4”代表rbcL的標(biāo)記位點(diǎn)，上標(biāo)字母代表對(duì)應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)核苷酸單倍型類(lèi)別。

Note: “M” means “matKgene”, “R” means “rbcL gene”, “H” means “haplotype”, “1, 2 and 3” mean the three fragment markedmatK1,matK2 andmatK3, respectively, and “4” meansrbcLfragment marked. The letter superscripts mean nucleotide haplotypes for fragment marked.

圖5　基于K2P模型的NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5　NJ (Neighbor-joining) phylogenetic tree based on K2P model

3　討論

3.1禾本科牧草標(biāo)記位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)

生物DNA 條形碼聯(lián)盟(consortium for the barcode of life， CBOL)提議的植物DNA條形碼候選片段有matK、rpoB、rpoC1、rbcL和psbA-trnH等序列，其中rbcL、matK和ITS為核心條形碼[4]，trnH-psbA為補(bǔ)充條形碼[16]。有研究報(bào)道，matK具有進(jìn)化速率快，種間鑒別能力較高等特點(diǎn)，但引物通用性差[17]。葡萄科崖爬藤屬的matK擴(kuò)增成功率達(dá)到93.5%，擴(kuò)增效果很理想，但單獨(dú)使用時(shí)物種識(shí)別率不高，僅為22.2%[18]。rbcL序列具有通用性高、易擴(kuò)增、易比對(duì)等特點(diǎn)，但變異主要存在于種以上水平，物種水平上通常變異不夠大[19-21]。盡管rbcL不能識(shí)別全部物種，但可以區(qū)分不少同屬植物[22]。因此，幾位研究者都曾建議將rbcL與另外一個(gè)或多個(gè)片段組合使用[18,22]。

本研究選擇matK和rbcL基因進(jìn)行研究，判定其是否符合DNA條形碼的候選條件。高度保守的通用引物設(shè)計(jì)是理想的DNA barcoding序列獲得的前提[23]。通過(guò)對(duì)GenBank中高粱屬、燕麥屬、大麥屬、稻屬、針茅屬和芨芨草屬等禾本科牧草葉綠體matK基因和rbcL基因的多重比對(duì)，篩選出高度保守區(qū)域，并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。獲得的matK(matK1、matK2、matK3)和rbcL共4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的引物(表2)，實(shí)現(xiàn)了目的片段地成功擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果較理想，為DNA barcoding數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供了可能性。DNA條形碼的核心是PCR擴(kuò)增，而退火溫度是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可相對(duì)減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR擴(kuò)增的特異性[24]。電泳結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增效率高、成功率高、反應(yīng)條件適宜，為物種的鑒別奠定了基礎(chǔ)。

3.2單倍型組合方式對(duì)禾本科牧草的鑒定

通過(guò)比較matK基因3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)單倍型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，matK基因3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(matK1、matK2、matK3)保守區(qū)片段大小依次較小，變異位點(diǎn)數(shù)也依次降低。在屬水平上，matK1無(wú)法區(qū)分早熟禾屬、羊茅屬和芨芨草屬，對(duì)于其余4個(gè)屬的牧草能準(zhǔn)確鑒別，屬水平的鑒別成功率為57.1%，種水平的鑒別成功率為62.5%。matK2無(wú)法區(qū)分芨芨草屬和早熟禾屬，屬水平鑒別成功率為71.4%，種水平鑒別成功率為 75%。而matK3擴(kuò)增成功率較低，未擴(kuò)增出黑麥草的兩個(gè)品種，存在5個(gè)變異位點(diǎn)，將8種牧草分為3個(gè)單倍型，僅區(qū)分出針茅屬，屬水平鑒別成功率僅為16.7%，與種水平相同。

通過(guò)分析rbcL鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在rbcL標(biāo)記位點(diǎn)的保守區(qū)內(nèi)存在33個(gè)變異位點(diǎn)，相比于matK基因的3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，rbcL變異最高，分為5個(gè)單倍型(H4A、H4B、H4C、H4D和H4E)，其中H4A、H4B、H4C和H4D之間相同的變異位點(diǎn)較多，而與甘肅羊茅和紫羊茅所屬的單倍型H4E相比均存在較大的差異。單倍型結(jié)果分析表明，rbcL基因僅能鑒別出早熟禾屬的草地早熟禾，黑麥草屬的多年生黑麥草和針茅屬的針茅3種牧草，其余5種牧草存在共享單倍型，無(wú)法鑒別。該結(jié)果符合rbcL基因需與其它片段組合使用的結(jié)論[22]。

本研究選擇matK和rbcL基因聯(lián)合使用進(jìn)行禾本科牧草的鑒別，4個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的單倍型組合構(gòu)成DNA識(shí)別碼，每種牧草都有其特異的DNA識(shí)別碼，在屬水平和種水平鑒別成功率均達(dá)到100%。而這種組合方式無(wú)法鑒別同一種牧草的不同品種，例如草地早熟禾的兩個(gè)品種鉆石和百勝具有共同的DNA識(shí)別碼，此外，多年生黑麥草的兩個(gè)品種貝克和凱帝莎以及紫羊茅的兩個(gè)品種百琪和夢(mèng)神均出現(xiàn)上述結(jié)果。

3.3基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的輔助鑒定

本研究通過(guò)分析多態(tài)位點(diǎn)，界定單倍型，通過(guò)標(biāo)記位點(diǎn)的不同單倍型組合實(shí)現(xiàn)8種牧草的鑒定，同時(shí)利用K2P模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，8種牧草分列于不同的進(jìn)化支。再次驗(yàn)證了matK和rbcL片段組合后，其鑒別效果明顯高于單片段。系統(tǒng)發(fā)育多樣性不受物種分類(lèi)地位變更的影響，是生物多樣性研究的一個(gè)里程碑式的指數(shù)[25-27]。李陳建等[28]對(duì)30份蘇丹草種質(zhì)資源的19個(gè)性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析，明確了蘇丹草種質(zhì)資源的不同類(lèi)型。本研究通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，充分證明了禾本科牧草各物種的單系性，其結(jié)果滿足DNA barcoding對(duì)包含足夠系統(tǒng)進(jìn)化信息進(jìn)行物種在分類(lèi)系統(tǒng)(科、屬等) 定位中的要求[23]。

4　結(jié)論

由上述結(jié)果可知，matK基因(matK1、matK2、matK3)和rbcL基因在種水平上的鑒定成功率較高。由于matK基因(matK1、matK2、matK3)和rbcL基因?qū)Σ糠治锓N仍然不能較好地區(qū)分，兩種片段組合后能將禾本科8種牧草完全區(qū)分，鑒定效率達(dá)到100%。因此，將matK與rcbL聯(lián)合應(yīng)用作為禾本科牧草的DNA條形碼通用序列組合。本研究結(jié)果為混合禾本科牧草飼料中的高丹草、玉米、芨芨草、針茅、多年生黑麥草、甘肅羊茅、紫羊茅和草地早熟禾的準(zhǔn)確識(shí)別提供了分子水平上的科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯武艷培)

Screening of universal DNA barcodes for grass forages’ eight species

Li Yong-qing1, Jiao Ting2, Wu Jian-ping1, Quan Jin-qiang1, Wang Wen-qiang1,Zheng Wang-shan1, Guo Yong-bo1, Yao Xi-xi1, Zhao Sheng-guo1

(1.Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China;2.College of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education, Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustaniability, Lanzhou 730070, China)

DNA barcoding is an emerging technology, which is used as a tool to indentify species accurately and quickly using the conservative DNA segments. Our research has established and optimized target fragments’ the amplification conditions for eleven samples (Sorghumbicolor×Sorghumsudanense,Zeamays,Stipacapillata,Loliumperenne‘Plxie’,Loliumperenne‘Caddieshack’,Festucakansuensis,Festucarubra‘Bargena’,F.rubra‘Maxima’,Poapratensis‘Barvictor’,P.pratensis‘Diamond’,Achnatherumsplendens) from seven major genera (Sorghum,Zea,Stipa,Lolium,Festuca,Poa,Achnatherum) and eight species according to nucleotide sequence of grass matK and rbcL genes in GenBank, and designed four universal primers. 5' end and 3' end conservative fragments in four marked fragments were selected by amplification products sequencing and analyzing. Single nucleotide polymorphism (SNP) haplotype analysis of conservative fragments nucleotide sequences of each maker loci showed there were 6 haplotypes(H1A, H1B, H1C, H1D, H1E and H1F), 7 haplotypes (H2A, H2B, H2C, H2D, H2E, H2F and H2G) and 3 (H3A, H3B and H3C) haplotypes among matK1, matK2, matK3 respectively, by the same token, rbcL gene has 5 haplotypes (H4A, H4B, H4C, H4D and H4E). According to the haplotypes about matK (matK1, matK2 and matK3) and rbcL, we have constructed the DNA barcoding for eight grass species. The research results provide a scientific basis for identification of mixed feed grasses including eight species of the seven generas.

haplotype combination;matKgene;rbcLgene; DNA barcoding; universal sequences

Zhao Sheng-guoE-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0039

植物生產(chǎn)層

2016-01-19接受日期：2016-05-30

甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2013A-64)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201503134)

李永青(1992-)，女，甘肅渭源人，在讀碩士生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail:m18894036031@163.com

趙生國(guó)(1976-)，男，甘肅慶陽(yáng)人，副教授，碩導(dǎo)，博士，主要從事動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用研究。E-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

S540.37

A

1001-0629(2016)9-1702-09*

李永青,焦婷,吳建平,權(quán)金強(qiáng),汪文強(qiáng),鄭王山,郭永博,姚喜喜,趙生國(guó).禾本科8種牧草DNA條形碼通用序列篩選.草業(yè)科學(xué),2016,33(9)：1702-1710.

Li Y Q,Jiao T,Wu J P,Quan J Q,Wang W Q,Zheng W S,Guo Y B,Yao X X,Zhao S G.Screening of universal DNA barcodes for eight forage grasses.Pratacultural Science，2016,33(9)：1702-1710.