陳宣文　危志鋒　林銳

摘要：為了探明尾礦先鋒植物的根際聯(lián)合固氮特性，對安徽銅陵林沖新棄置銅尾礦主要優(yōu)勢先鋒植物香蒲（濕生）、白茅（旱生）根際聯(lián)合固氮特性進(jìn)行系統(tǒng)性研究。研究結(jié)果表明：香蒲、白茅根際土柱固氮活性分別為32.43、19.27 μmol/（m2·h），二者差異明顯。分析2種植物根系和根際土固氮活性發(fā)現(xiàn)，香蒲根系和根際土的固氮活性大于白茅，表明植物根際聯(lián)合固氮活性與植物種類有關(guān)。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性排序為：根系>根際土>根外土>空白，表明植物根系是植物重要的固氮部位。從尾礦不同樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株，固氮活性在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h）之間。對其中2株高活性的菌株ATWG5、ATWG9進(jìn)行16S r DNA 序列分析，結(jié)果表明ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關(guān)系最近，相似性達(dá)到100%，ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近，相似性達(dá)到98.75%。

關(guān)鍵詞：銅尾礦；先鋒植物；根際聯(lián)合固氮；固氮活性；香蒲；白茅

中圖分類號： X171.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0488-04

尾礦是經(jīng)礦石粉碎、浮選后余下的微粒狀固體，絕大多數(shù)尾礦被堆置在尾礦庫內(nèi)，丟棄后的尾礦庫形成了尾礦廢棄地，這不僅占有和破壞大量土地，還給周邊地區(qū)帶來諸如空氣、水污染，生態(tài)系統(tǒng)退化，農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)降低等一系列問題[1]。

植被恢復(fù)是治理尾礦污染的一種較為理想的方法[2-3]，但尾礦所具有的如物理結(jié)構(gòu)性差、異常貧瘠（如有機(jī)質(zhì)、氮素含量幾乎為零）、極端pH值、重金屬濃度過高等特性，對植被恢復(fù)極為不利。盡管如此，隨著棄置年限的增加，尾礦原生環(huán)境中先鋒植物開始定居。實地考察發(fā)現(xiàn)，林沖尾礦未復(fù)墾廢棄地先鋒植物以非豆科植物為主，表明尾礦極端生境中非豆科植物先鋒植物生長過程中具有穩(wěn)定而可靠的氮源，認(rèn)為這些氮源主要來自先鋒植物根際聯(lián)合固氮[4]。

聯(lián)合固氮是自由生活的固氮菌定植于植物根表細(xì)胞和根際土壤中形成的特殊固氮作用。當(dāng)固氮微生物定植在植物根際，并與之形成一種松散的聯(lián)合固氮狀態(tài)時，植物根系就為其提供良好的固氮環(huán)境，與自生固氮相比表現(xiàn)出更高的固氮效率[5]。研究表明，聯(lián)合固氮菌通過固氮作用除了為宿主植物提供氮素營養(yǎng)之外，還可以通過分泌植物生長激素類物質(zhì)等多種途徑促植物生長[6]。目前，有關(guān)根際聯(lián)合固氮的認(rèn)識，主要關(guān)于普通環(huán)境及生長在普通環(huán)境的植物上，而關(guān)于尾礦極端生境的先鋒植物根際聯(lián)合固氮的信息明顯缺乏。

本研究通過對安徽銅陵林沖新棄置的銅尾礦2種具有代表性的優(yōu)勢先鋒植物香蒲（濕生）、白茅（旱生）根際聯(lián)合固氮活性的分析，可為明確銅尾礦生態(tài)系統(tǒng)氮素的積累和植被的生態(tài)恢復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2014年7月，于安徽省鳳凰山林沖新棄置未復(fù)墾尾礦，采集尾礦裸露地（空白）、結(jié)皮、香蒲、白茅根際土柱，同時采集香蒲、白茅根、根外土（距離根部較遠(yuǎn)，根系沒有影響的地方）及空白（未生長植被的裸露地），裝入自封采樣袋中帶回實驗室于4 ℃冰箱中保存，待測。

1.1.1 土柱取樣 用直徑為4.8 cm、長度為12 cm的PVC管子套住植物，從上到下打入土中，上部留有1 cm左右的間隙，用鏟子將土柱完整鏟出，放入自封袋中帶回實驗室待測。

1.1.2 土柱處理 將取回的土柱放入體積約為450 mL、帶有換氣孔的玻璃瓶中，用50 mL注射器通過橡皮塞抽出 35 mL 的氣體（約為放入樣品之后剩余體積的10%），同時充入同體積的純C2H2氣體。培養(yǎng)36 h后用氣相色譜儀測量C2H4的生成量。每個樣品重復(fù)3次。

1.1.3 根系、根際土、根外土和空白處理 將植物的根系（完全去除根表面土壤）、根際土（根表面5 mm內(nèi)土壤）、根外土（距根系較遠(yuǎn)，根系影響不到的地方）與空白對照放入體積約為35 mL試管中，用膠塞封閉試管口，用5 mL注射器通過橡皮塞抽出2 mL氣體（約為放入樣品之后剩余體積的10%），同時充入同體積的純C2H2氣體，每個樣品做3個重復(fù)。培養(yǎng)24 h后用氣相色譜儀測量C2H4濃度，并換算成1 g樣品1 h內(nèi)乙烯生成量。

1.2 培養(yǎng)基

Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基配方：蔗糖5.0 g、甘露醇5.0 g、蘋果酸5.0 g、乳酸鈉0.5 mL、K2HPO4·H2O 0.1 g、KH2PO4·H2O 0.4 g、NaCl 0.1 g、FeCl3 0.01 g、NaMoO4 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.2 g（單獨滅菌）、CaCl2·2H2O 0.02 g（單獨滅菌），用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2。

1.3 固氮菌的分離與測定

分別準(zhǔn)確稱取10 g香蒲、白茅的根系（表面帶有土壤）于無菌研缽中，加無菌水研磨成糊狀，轉(zhuǎn)移定容至100 mL；繼續(xù)稀釋制成系列稀釋樣品，空白土壤直接梯度稀釋，分別從10-4、10-5稀釋液中取0.1 mL均勻涂布在Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)，2 d后計數(shù)。挑取單菌落劃線純化后，保存。

分離得到的菌株用乙炔還原法確定其是否具有固氮活性，具體操作將分離得到的菌株接種到裝有5 mL Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基的試管斜面中培養(yǎng)1 d后，將試管剩余空間的10%置換為C2H2（約為2 mL）后換上膠塞封閉試管口，于 28 ℃ 培養(yǎng)1 d后，用氣相色譜儀測定其固氮活性。

1.4 測定方法

1.4.1 固氮活性測定方法 采用乙炔還原法測定聯(lián)合固氮活性[7]。采用Agilent GC7890A氣相色譜儀，檢測器為FID檢測器，毛細(xì)管柱子型號：PLOT SILICAPLOT 30×32；測定樣品[用1 mL試管抽取0.5 mL氣體和標(biāo)氣（乙烯標(biāo)氣濃度為49 mg/L]中C2H4的峰面積。

計算樣品固氮活性公式：

NA=A1A2×C×V×122.4×1t×1S×273273+T×P760。

式中：NA為C2H4氣體的生成速率，mmol/（m2·h）；A1為樣品中C2H4的峰面積；A2為標(biāo)氣中C2H4的峰面積；C為C2H4標(biāo)氣的濃度；V為培養(yǎng)起的體積，L；t為培養(yǎng)時間；S為樣品的垂直投影面積，m2；T為向培養(yǎng)器中注入C2H2氣體時的環(huán)境溫度，℃；P為向培養(yǎng)器中注入C2H2氣體時的大氣壓，mmHg。

1.4.2 理化性狀測定 pH值、尾礦土壤全氮含量、有效磷含量、有效鉀含量按《土壤理化分析》中描述的方法[8]測定。全銅含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法[9]測定。

腐殖質(zhì)碳含量的測定：由于銅礦尾礦中含有大量金屬硫化物（即S2-），不能用重鉻酸鉀法直接測定，而改用焦磷酸鈉-氫氧化鈉浸提重鉻酸鉀法測定[7]腐殖質(zhì)含碳量。

1.4.3 總DNA提取 使用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號DP302-02）對固氮菌基因組DNA進(jìn)行提取，最后用TE緩沖液溶解DNA至濃度為50～100 ng/μL，于-20 ℃保存。

1.4.4 16S rDNA序列測定及分析 使用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL，組成：32.75 μL滅菌超純水，5 μL 10×buffer，5 μL BSA，4 μL dNTP，27F、1492R引物各1 μL，0.25 μL rTaq酶，1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 1 min，-0.5 ℃/循環(huán)，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 20 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，確定目的條帶單一，即送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。使用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進(jìn)行比對，并下載相近的序列；然后使用CLUSTAL X軟件進(jìn)行對比分析[10]；最后用MEGA version 4.1[11]將測序得到的序列和基因庫已知的相近序列，以Kimura 2-Parameter為模型，采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性狀

尾礦土壤理化性質(zhì)：pH值7.9，銅含量1 675.53 mg/kg，鉻含量79.93 mg/kg，鉛含量476.71 mg/kg，全氮含量 0.28 mg/kg，速效磷含量0.48 mg/kg，速效鉀含量 49.98 mg/kg，腐殖質(zhì)碳含量0.73 mg/kg。尾礦土壤中銅含量為1 675.53 mg/kg，嚴(yán)重超出400 mg/kg 的GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》三級標(biāo)準(zhǔn)，這與鳳凰山的林沖尾礦庫的礦砂主要來自銅礦有關(guān)。尾礦裸露地土壤的全氮含量為 0.28 mg/kg，而當(dāng)土壤全氮含量在0.03%～0.08%范圍內(nèi)，就很難滿足植物正常生長的需求。植被的枯枝落葉是土壤有機(jī)質(zhì)的主要來源，尾礦土壤腐殖質(zhì)碳含量主要與尾礦表層上的植被狀況有關(guān)，導(dǎo)致裸露地的腐殖質(zhì)炭含量較低，僅為 073 mg/kg。表明尾礦土壤環(huán)境惡劣，不利于植物的定居生長。

2.2 固氮活性

2.2.1 土柱固氮活性 用乙炔還原法測定香蒲、白茅根際土柱，空白、結(jié)皮土柱（尾礦不同部位土柱）的固氮活性，測定結(jié)果見圖1。

由圖1可見，尾礦廢棄地不同部位土柱都具有一定的固氮活性，固氮活性范圍在0.09～32.43 μmol/（m2·h），不同樣品有明顯差異。香蒲、白茅根際土柱固氮活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于結(jié)皮 1.30 μmol/（m2·h） 和空白0.09 μmol/（m2·h）。2種植物白茅、香蒲的根際土柱固氮活性相差很大，濕生植物香蒲的固氮活性可以達(dá)到32.43 μmol/（m2·h），而陸生植物白茅僅有19.27 μmol/（m2·h），表明濕生地更有利于植物根際聯(lián)合固氮作用。在結(jié)皮和空白土柱樣品中也測到固氮活性，但明顯低于植物根際固氮活性。認(rèn)為在尾礦環(huán)境中存在可以自由固氮的微生物。尾礦結(jié)皮固氮活性低于沙漠生物結(jié)皮的固氮活性[12]，與尾礦理化性質(zhì)比沙漠更加惡劣有關(guān)。有研究表明，固氮活性受水分的影響[12]，在一定水分范圍內(nèi)，固氮活性隨著水分的增加而增高，本研究結(jié)果也表現(xiàn)出相同趨勢（圖2）。

2.2.2 根際不同部位固氮活性 為了進(jìn)一步確定植物聯(lián)合固氮活性的差異，用乙炔還原法測定植物根際不同部位（根系、根際土、根外土）的固氮活性的大小，測定結(jié)果見圖3。

由圖3可見，香蒲、白茅根際不同部位固氮活性都有相同變化趨勢，即根系>根際土>根外土，這可能與不同部位有機(jī)

物含量有關(guān)，即有機(jī)物含量極度貧乏的尾礦原生環(huán)境中，有機(jī)物含量越高，固氮活性就越高，反之亦然。尾礦中有機(jī)物主要來源植物根系分泌物、根系老化組織的脫落物[13]，含量分布以根系為中心向外依次降低，這種變化趨勢與植物根際不同部位固氮活性變化趨勢相一致。香蒲根系和根際土的固氮活性均大于白茅，表明尾礦植被固氮活性與植物種類有關(guān)。植物生長發(fā)育過程中不斷地向根際土壤釋放有機(jī)物（如根系分泌物、表皮脫落物、根系死亡殘體等），不同種類植物及不同生育進(jìn)程，植物向根際釋放的有機(jī)物化學(xué)組分及總量會不盡相同，這決定了根際微生物的選擇性分布，也就是說不同植物種類及其生育進(jìn)程可以影響根際聯(lián)合固氮。香蒲和白茅的土柱固氮活性也反映這一點。

2.3 固氮菌數(shù)量

針對香蒲、白茅根際及未生長植物的裸露土壤（空白）進(jìn)行固氮菌的分離，分離結(jié)果見圖4。尾礦裸露土壤、白茅根際和香蒲根際都能分離到固氮菌，數(shù)量在8.42×105～2.27×106個/g干質(zhì)量之間。香蒲、白茅的固氮菌的數(shù)量（×106數(shù)量級）略高于空白樣品中的固氮菌的數(shù)量（×105數(shù)量級）。這與植物根際有機(jī)物濃度高于空白有關(guān)。尾礦固氮微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常土壤微生物數(shù)量（×108數(shù)量級）[14]，表明尾礦極端生境不利于微生物的生長。香蒲、白茅的固氮活性卻相差很大，香蒲、白茅根際固氮菌的數(shù)量相差不大（×106數(shù)量級），至少表明可分離的固氮菌數(shù)量不是影響根際聯(lián)合固氮活性的主要因素。

2.4 固氮菌菌株種類及固氮活性

對分離得到的21株菌株用乙炔還原法測定其固氮活性。結(jié)果共得到12株具有固氮活性的菌株，分析結(jié)果見表1。ATWG1、ATWG2、ATWG3號3株菌株在所有樣品中都存在，具有普遍性。而ATWG8、ATWG9號2株菌株只在香蒲樣品中存在，ATWG5號菌株只在白茅樣品中存在，具有專一性。12株

菌株固氮活性在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h），不同菌株的固氮活性差異很大。固氮活性最高和最低之間相差了近478倍。從白茅樣品中分離的ATWG5號菌株、香蒲中分離的 ATWG9 號菌株固氮活性遠(yuǎn)高于何福恒等從水稻、玉米、甘蔗根際分離獲得的固氮菌活性[分別為2～819、880～894、299～934 nmol/（mL·h）][15]，也高于田宏等從草坪草根際分離的固氮菌活性[37.78～180.20 nmol/（mL·h）][16]、田穎等從小麥根際分離的固氮菌活性[30.14～100.77 nmol/（mL·h）][17]，表明白茅根際分離得到的ATWG5號固氮菌株、香蒲根際分離得到的ATWG9號固氮菌株具有較高固氮活性。尾礦先鋒植物根際聯(lián)合固氮，歸根到底是根際固氮菌與其周圍環(huán)境共同作用的結(jié)果，固氮菌是內(nèi)因。固氮菌活性的大小可以影響植物根際聯(lián)合固氮能力的大小。從香蒲樣品中分離得到1株高固氮活性的菌株也說明了這點。

對菌株的固氮活性用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，可以得出ATWG1、ATWG5、ATWG8、ATWG9、ATWG10 5種菌株固氮活性差異顯著。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對具有高固氮活性的2株菌株ATWG5、ATWG9進(jìn)行總DNA提取、PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進(jìn)行比對，并下載相近的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG5號菌株同源性最近的3株菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），從圖5可以看出，ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關(guān)系最近，16S rDNA序列同源性為100%。研究發(fā)現(xiàn)，Azorhizobium caulinodans與長喙田菁（Sesbania rostrata）共生，既可以形成根瘤，又可以形成莖瘤，具有較高的固氮活性[18]。

在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG9號菌株同源性最近的4株菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。從圖6可以看出，ATWG9號菌株雖然單獨為1支，但是與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近，16S rDNA序列同源性為98.75%。李樹品等從小麥根系分離得到產(chǎn)酸克雷伯菌，并通過乙炔還原法證明其具有高固氮活性[19]。

3 結(jié)論與討論

林沖尾礦不同部位都具有生物固氮活性，固氮活性大小為香蒲>白茅>結(jié)皮>空白，尾礦不同部位的固氮作用，有效提高了銅尾礦表層基質(zhì)的總氮含量，有利于后期植物生長。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性大小為根系>根際土>根外土，表明植物根系是植物重要的固氮部位，根際的生物固氮，對尾礦的先鋒植物固氮有效性最直接。

從植物根際分離得到的固氮菌數(shù)量明顯高于裸露土壤，但小于正常土壤的微生物含量。從尾礦不同部位樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株，固氮活性范圍在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h）；植物種類影響了固氮菌的選擇性分布，這些固氮菌固氮直接參與植物的聯(lián)合固氮作用，進(jìn)而影響植物聯(lián)合固氮活性。

針對2株高活性菌株進(jìn)行16S rDNA測序比對表明，ATWG5 號菌株與Azorhizobium caulinodans親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到100%，ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近，相似性達(dá)到98.75%。

在氮素極其匱乏的尾礦極端環(huán)境中，優(yōu)勢先鋒植物主要是非豆科植物，這些先鋒植物并不能進(jìn)行類似豆科植物共生固氮作用，只能進(jìn)行聯(lián)合固氮作用，為植物提供生長所必需的氮素。而植物聯(lián)合固氮作用歸根到底是聯(lián)合固氮微生物的作用，固氮微生物與宿主植物有密切關(guān)系。有研究表明，不同聯(lián)合固氮菌的固氮活性有明顯差異，相差幾十倍甚至更多[20]，本研究結(jié)果也證明了這點。在本研究中，可以得出尾礦先鋒植物的固氮活性不同，根際固氮微生物的數(shù)量不盡相同；同時也得出不同植物根際固氮微生物的種類也不盡相同，不同固氮微生物的固氮活性差異很大。固氮微生物這種數(shù)量活性的差異共同影響了植物的聯(lián)合固氮作用。然而，關(guān)于固氮微生物對宿主植物聯(lián)合固氮活性的影響機(jī)理還須進(jìn)一步研究。

在尾礦自然條件下，先鋒植物存在聯(lián)合固氮菌株，但是相對于龐大的根際微生物來說其種群數(shù)量較少，與其他微生物競爭力有限，固氮量甚微[21]。對于尾礦生態(tài)修復(fù)，可以將來源于尾礦先鋒植物根際的高效固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以接種劑的形式施入先鋒植物根際，提高根際固氮菌種群數(shù)量，增強(qiáng)群競爭力，增加根際微生物固氮總量。本研究獲得的固氮菌菌株大多數(shù)生長速度較快，在土壤中存活定居可能性大，將這些固氮菌株應(yīng)用于尾礦的生態(tài)修復(fù)具有良好應(yīng)用前景。

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