曹劍鋒　任朝輝　蘆靜波

摘要：通過對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、·OH的清除活性、還原力、螯合能力、總抗氧化能力的測定，評價矮冷水花水提取物、95%乙醇提取物及其石油醚相、乙酸乙酯相和水溶性3個不同極性部位的抗氧化活性；測定總黃酮、總酚含量；采用化學反應鑒別法對矮冷水花提取物進行化學成分預試驗。預試驗結(jié)果表明：矮冷水花可能含有酚類、鞣質(zhì)、黃酮類、揮發(fā)油或油脂、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖、苷類、甾體、萜類內(nèi)酯、香豆素及其苷類化學成分。試驗結(jié)果表明：水提取物、95%乙醇提取物以及其石油醚相、乙酸乙酯相、水溶性部位提取物均表現(xiàn)出一定抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的黃酮、總酚含量最高，分別為28.43%、2.16%，清除DPPH自由基、·OH的能力、還原力、螯合力及總抗氧化能力的IC50值分別為0.142、0.598、0.328、1.008、0.298 mg/mL，并且隨著濃度的增加，清除活性增強。綜合試驗結(jié)果可知，矮冷水花提取物具有很好的抗氧化活性，乙酸乙酯部位抗氧化活性最強。

關(guān)鍵詞：矮冷水花；化學成分；提取物；抗氧化活性；藥用價值

中圖分類號： S132 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0307-05

矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]屬蕁麻科，為一年生草本，別稱地油仔、苔水花。矮冷水花分布于我國華東、西南等地，常被作為蔬菜食用，因具有清熱解毒、祛痰止痛、消炎、褪腫、通便、利尿等功效，民間用于清熱解毒祛瘀止痛、跌打損傷、無名腫毒、毒蛇咬傷、瘡癤等癥[1]。陳謝生等研究矮冷水花并制成了適合防治多種毒蛇的蛇傷草藥[2]；張浩等對矮冷水花進行了生藥學鑒定研究[3]。有關(guān)矮冷水花的研究報道較少，本研究對矮冷水花的化學成分和對水提物、乙醇提取物不同萃取物抗氧化活性進行初步研究，以期為矮冷水花植物藥用價值的開發(fā)應用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

矮冷水花，采自貴陽市烏當區(qū)，經(jīng)貴州師范學院朱富壽教授鑒定為蕁麻科植物矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]。

1.2 主要藥品及試劑

石油醚、乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、茚三酮、三氯化鐵、溴甲酚綠、乙酸、碘化汞鉀、碘、碘化鉍鉀、硅鎢酸、堿性苦味酸、3，5-二硝基苯甲酸、氫氧化鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、菲咯嗪（ferrozine）、硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、蕓香苷、亞硝酸鈉、硝酸鋁、沒食子酸、碳酸鈉等，均為分析純。

1.3 試驗儀器

722分光光度計，上海精密科學儀有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司。

1.4 不同提取物的制備

1.4.1 水提物的制備 稱取100 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸餾水，浸泡24h，然后于40 ℃ 超聲2 h，過濾、濃縮凍干，即得水提物，冷藏備用。

1.4.2 乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水溶性提取物的制備 稱取500 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入乙醇（95%），不時振蕩，浸泡24 h；然后于40 ℃超聲2h，過濾，從濾液中回收乙醇至無醇味；取1/4量濃縮液作為乙醇提取物，濃縮凍干，冷藏備用；剩余3/4濃縮液先用石油醚萃取3次，過濾，回收石油醚，濃縮凍干，即得到石油醚提取物，冷藏備用。取上述剩余的濃縮液，加入500 mL 5%鹽酸，充分攪拌、過濾，將過濾部分做酸水試驗。酸水不溶部分加500 mL乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯液用 500 mL 5%NaOH溶液振搖洗滌2次，棄去堿水層；乙酸乙酯層再用蒸餾水洗2次，至水洗液呈中性反應，棄去水洗液，回收乙酸乙酯，濃縮凍干，即得乙酸乙酯提取物，不溶于乙酸乙酯的部分為水溶性提取物，將其冷藏備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 化學成分預試驗 （1）用石油醚提取物分別做揮發(fā)油、油脂、甾體的預試驗，方法見表1。（2）用乙醇、乙酸乙酯提取物做酚類、鞣質(zhì)、植物甾體、三萜類、蒽醌類、黃酮類、生物堿、香豆素與內(nèi)脂、強心苷等預試驗，方法見表2、表3。（3）用酸水提取物做生物堿預試驗，方法見表4。（4）用水提取物做氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖、多糖、苷類、鞣質(zhì)、有機酸、皂苷等預試驗，方法見表5。

1.5.2 黃酮含量的測定 取100 μL樣品原液于試管中，加30%乙醇補齊到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻；放置6 min 后，再加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液；加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min后，在515 nm波長處測定上述標準溶液的吸光度[4]。

標準曲線的制作。精確配制濃度為0.1 mg/mL的對照品蕓香苷的標準液，分別精確吸取0、1、2、3、4、5 mL標準液于6支具塞試管中，加30%乙醇補齊到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻；放置6 min后，再加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液；加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min后，在515 nm波長處測定上述標準溶液的吸光度，制作標準曲線，得到回歸方程：

y=0.270 8x-0.001 5，r2=0.990 1。

式中：y為吸光度D515 nm；x為蕓香苷濃度，mg/mL。

1.5.3 總酚含量的測定 取100 μL原液樣品于試管中，加水補齊到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，振蕩20 s后反應5 min；再加入2 mL7.5%碳酸鈉溶液，振蕩20 s后反應1 h，于760 nm測定吸光度D760 nm[5]。

標準曲線的制作。配制濃度為100 μg/mL的沒食子酸溶液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，共6支試管，加水補齊到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，振蕩20 s后反應5 min；再加入2 mL7.5%碳酸鈉溶液，振蕩20 s后反應1 h，在760 nm處測定吸光度D760 nm?？瞻讓φ沼谜麴s水代替樣品，制作標準曲線，得到回歸方程：

y=34.799x+0.002 2，r2=0.999 1。

式中：y為吸收光度D760 nm；x為沒食子酸濃度，mg/mL。

1.5.4 不同部位的抗氧化活性測定 （1）DPPH·清除活性。以95%乙醇為溶劑，配制濃度0.2 mmol/L的DPPH·溶液。加樣品后于試管中補齊至1 mL，加入1 mL DPPH溶液，使總體積為2 mL，搖勻。室溫放置30 min后記錄517 nm處吸光度D517 nm（樣品）[6-7]；向1 mL DPPH·溶液中加入1 mL蒸餾水，記錄吸光度D517 nm（空白），即為空白對照；以維生素C為陽性對照。根據(jù)以下公式計算樣品DPPH·清除率：

DPPH·清除率=（D517 nm（空白）-D517 nm（樣品））/D517 nm（空白）×100%。

（2）·OH清除活性。分別在試管中加入1 mL 3 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL 005%過氧化氫溶液，立即混勻，然后加入不同體積的樣品溶液并補齊至1 mL。以等體積的蒸餾水作為空白對照，于 37 ℃ 反應30 min，在510 nm下測量吸光度D510 nm（樣品）、D510 nm（空白）[8]。以1 mL 3 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2 mL蒸餾水作為本底吸收（調(diào)零管）。相應公式為：

清除率=（D510 nm（空白）-D510 nm（樣品））/D510 nm（空白）×100%。

（3）還原力測定。加入不同體積的樣品后補齊至1 mL，再加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液和25 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min；加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min；取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL三氯化鐵（0.1%），于700 nm 處測定吸光度D700 nm[9-10]，以維生素C為陽性對照。

（4）螯合能力測定。加入不同體積的樣品后補齊至 1 mL，再加入3.7 mL蒸餾水、0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵（FeCl2）溶液，振蕩30 s，混合均勻；然后加入0.2 mL 0.5 mmol/L ferrozine啟動反應，室溫放置30 min；接下來于3 000 r/min 離心 5 min，取上清液在562 nm處測定吸光度D562 nm，以EDTA為對照[11]。

（5）總抗氧化能力的測定。加入不同體積的樣品后補齊至1、4 mL，試劑中含0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨，混勻后于95 ℃水浴中恒溫90 min，在695 nm 波長下測其吸光度D695 nm。空白用1 mL蒸餾水代替樣品液，以維生素C作為陽性對照[12]。

1.5.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS 11.5軟件進行t檢測處理 。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學成分預試驗結(jié)果

石油醚提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、酸水提取物、水提取物化學鑒別試驗結(jié)果分別見表1至表5。

2.2 矮冷水花不同提取物黃酮、酚類含量

由表6可以看出：矮冷水花乙酸乙酯提取物的總黃酮含量最高，為28.43%；其次是乙醇提取物中的含量，為2176%；水溶性、水提取物中黃酮含量分別為1.83%、192%。因此，矮冷水花黃酮主要集中在乙酸乙酯、乙醇部分，矮冷水花乙酸乙酯提取物的總酚含量為2.16%，含量最高；乙醇提取物、水溶性、水提取物總酚含量分別為077%，0.59%、0.27%，因此可知，矮冷水花總酚含量主要集中在乙酸乙酯部分，其次是乙醇部分。

2.3 DPPH· 清除活性

從圖1可以看出，矮冷水花不同提取物對DPPH·均具有一定的清除作用，且隨著提取物濃度的增加，清除能力逐漸增強；在濃度為0.5 mg/mL時，乙酸乙酯提取物對DPPH·清除活性可達到97.0%，高于同濃度乙醇提取物的76.2%、水溶性部分的53.7%，以及水提物的7.4%。因此可知，矮冷水花乙酸乙酯提取物對DPPH·清除活性最強。

2.4 ·OH清除活性

從圖2可以看出，矮冷水花不同提取物對·OH均具有一定的清除作用，且隨著提取物濃度的增加，清除活性逐漸增強。在濃度為1.5 mg/mL時，乙酸乙酯提取物對·OH清除活性可達到99.9%，同濃度的水提物、乙醇提取物、水溶性部分的清除率分別為94.8%、73.2%、67.7%。因此矮冷水花乙酸乙酯提取物對·OH自由基清除活性最強，其次為水提取物部位。

2.5 還原力測定

從圖3可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的還原能力，且隨著提取物濃度的增加，還原能力逐漸增強。在濃度為1 mg/mL時，乙酸乙酯提取物還原能力D700 nm為1.31，同濃度的乙醇提取物、水溶性部分、水提物D700 nm分別為0.78、0.39、0.19。因此，矮冷水花乙酸乙酯提取物的還原能力最強。

2.6 螯合能力測定

從圖4可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的螯合能力，且隨著提取物濃度的增加，螯合能力逐漸增強。在濃度為1.2 mg/mL時，水提取物螯合能力D562 nm為0.87，同濃度的乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶性部分的D562 nm分別為0.53、0.52、0.16。因此可知：矮冷水花水提取物的螯合能力最強，乙酸乙酯提取物次之。

2.7 總抗氧化能力的測定

從圖5可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的總抗氧化能力，且隨著提取物濃度的增加，總抗氧化能力逐漸增強。在濃度為1.2 mg/mL時，乙酸乙酯提取物總抗氧化能力D695 nm為1.35，高于同濃度的乙醇提取物的0.52；水溶性提取物的D695 nm為0.13，明顯高于水提物的0.01。因此可知，矮冷水花水提取物的總抗氧化能力最強，主要集中在乙酸乙酯、乙醇提取物部位。

2.8 矮冷水花不同提取物抗氧化IC50值

由表7可見，在4個不同提取物中，清除DPPH·能力、還原力、總抗氧化能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，其中乙酸乙酯提取物清除DPPH·的活性約為維生素C的1/10，乙醇提取物約為維生素C的1/20左右； 清除·OH自由基活性能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>水提物>乙醇提取物>水溶性，水提物表現(xiàn)較強的清除·OH活性，其活性約為純品維生素C的1/6；螯合能力大小依次是：水提物>乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性。3 結(jié)論

預試驗結(jié)果初步表明：矮冷水花中可能含有黃酮類、酚類、香豆素類、揮發(fā)油、植物甾醇、糖類、苷類、鞣質(zhì)、有機酸等化學成分。本研究初步確定了矮冷水花可能存在的化學成分， 為矮冷水花活性成分的提取、分離、純化和篩選研究提供了科學依據(jù)。

本研究表明，植物提取物的抗氧化活性與植物中多酚、黃酮含量密切相關(guān)[13-16]。通過對比冷水花抗氧化活性與總黃酮、總酚含量可知，矮冷水花提取物不同極性部位黃酮、總酚含量大小依次為：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物。體外抗氧化研究結(jié)果表明：4種提取物對DPPH·清除力、還原力、螯合力、總抗氧化力均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，次序是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，對DPPH·表現(xiàn)出中等極性乙酸乙酯的活性較強，極性大的水部位相對較弱，但對羥自由基清除能力方面，水提取物明顯較強。總之，本試驗結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物部位是矮冷水花抗氧化活性的主要部位，提示黃酮、多酚類化合物是矮冷水花抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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