劉穎　李冬杰　王沛沛

摘要：為優(yōu)化懷牛膝（Achyranthes bidentata BL.）組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，以懷牛膝莖段作為外植體，選擇MS為基本培養(yǎng)基，研究不同激素配比對(duì)組培快繁的影響。結(jié)果表明，3種激素對(duì)于外植體芽誘導(dǎo)中影響順序依次為6-BA>IBA>KT，最佳芽誘導(dǎo)優(yōu)化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。誘導(dǎo)叢生芽增殖的培養(yǎng)基以MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT為最優(yōu)，增殖系數(shù)達(dá)6.03。優(yōu)化生根培養(yǎng)以1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，達(dá)95.1%。組培苗移栽至炭灰 ∶ 營(yíng)養(yǎng)土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質(zhì)中，成活率達(dá)到100%，且植株生長(zhǎng)健壯。

關(guān)鍵詞：懷牛膝；組織培養(yǎng)；快速繁殖；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q945.5；S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0083-04

懷牛膝（Achyranthes bidentata BL.）屬莧科牛膝屬多年生草本植物，高70～120 cm，生長(zhǎng)于河南沁陽(yáng)、武陟、修武、溫縣一帶，為中國(guó)著名的“四大懷藥”之一[1]。其根呈圓柱形，直徑5～10 mm，土黃色；莖有棱角或四方形，綠色，有的還帶有紫色；葉片一般是橢圓形或是橢圓披針形，基部呈楔形或是寬楔形。懷牛膝因其根含皂苷元、齊墩果酸、蛻皮激素、牛膝多糖等有效成分，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通血脈、降血壓、鎮(zhèn)痛、引藥下行和瀉濁通淋等功效[2]，所以越來(lái)越受到人們的青睞，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。為了滿足市場(chǎng)需求，須要對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)栽培。近年來(lái)，對(duì)于牛膝的組織培養(yǎng)研究也有相關(guān)報(bào)道[3-5]，但對(duì)于外植體選擇、激素配比及叢生芽分化上還存在一些問(wèn)題[6-7]。本研究選取懷牛膝莖段為外植體，建立并優(yōu)化懷牛膝的組織培養(yǎng)及快繁體系，以期獲得最佳的組培條件，整體提高懷牛膝組培的效率，為其藥用成分的長(zhǎng)期工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料由河北科技大學(xué)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供，以含有1～2個(gè)芽眼的懷牛膝2 cm幼嫩莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理 選取懷牛膝2 cm帶腋芽莖段，先用去離子水沖洗，再加入稀釋的洗潔精清洗，之后置于超凈工作臺(tái)上。用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞消毒3 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，用消毒濾紙吸干水分，在無(wú)菌條件下，把消毒后的莖段切成0.5 cm 的小段待接種。

1.2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基（蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值為5.7～5.8），添加不同濃度的6-BA、IBA、KT，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表（表1），以篩選出最佳的激素組合，確定最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將消毒處理后的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基中接種3個(gè)，重復(fù)3次，置于培養(yǎng)室中，進(jìn)行培養(yǎng)并定期觀察不同外植體的誘導(dǎo)及分化情況，14 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)外植體誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)。

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基（蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值為5.7～5.8），添加IBA 0.5 mg/L、KT 0.2 mg/L及3種不同濃度梯度的6-BA（表2），以篩選出最佳的6-BA濃度，確定最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基。切取1 cm長(zhǎng)的單芽接種至3種增殖培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，置于培養(yǎng)室中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，觀察叢生芽增殖及生長(zhǎng)情況，25 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=叢生芽分化的個(gè)數(shù)/叢生芽分化的外植體數(shù)）。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 切取生長(zhǎng)較粗壯的叢生芽接種于1/2 MS培養(yǎng)基 （蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值5.7～5.8） 上，并添加不同濃度的激素 （表3）進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種約30個(gè)叢生芽。觀察根的萌發(fā)及生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)、生根數(shù)和生根率（生根率=生根的組培苗數(shù)/接種的組培苗數(shù)×100%）。

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室的溫度為（25±2） ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d。

1.2.6 練苗與移栽的優(yōu)化 當(dāng)生根苗長(zhǎng)至5 cm時(shí)，置于溫室中揭去瓶蓋練苗4 d。然后用鑷子取出小植株，流水洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽至苗床上，苗床基質(zhì)采用4種處理，分別為（1）草炭土；（2）營(yíng)養(yǎng)土；（3）草炭土+營(yíng)養(yǎng)土+蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）；（4）營(yíng)養(yǎng)土+蛭石（體積比2 ∶ 1）。將移栽苗置于相對(duì)濕度80%～90%、溫度（25±2） ℃的環(huán)境中遮陰培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，用1/2 MS的大量元素的營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕基質(zhì)，觀察懷牛膝苗的生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率，并比較生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體芽誘導(dǎo)的優(yōu)化

將處理后的懷牛膝帶芽莖段分別接種于不同激素濃度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在相同條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)，比較不同激素濃度配比對(duì)外植體芽誘導(dǎo)的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

從表4可以看出，試驗(yàn)中選取的3種激素，即6-BA、IBA、KT對(duì)懷牛膝外植體的誘導(dǎo)均具有影響。通過(guò)極差分析得出，3種激素對(duì)于叢生芽誘導(dǎo)的影響從強(qiáng)到弱依次為 6-BA>IBA>KT，3種激素最優(yōu)水平的組合是A2B1C2。方差分析結(jié)果表明，3種影響因素的不同水平之間均存在極顯著差異，3種激素的不同濃度配比對(duì)外植體的誘導(dǎo)具有極顯著的影響。

在9種不同濃度的激素組合培養(yǎng)基中外植體芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況不同（表4、圖1）。接種在4號(hào)培養(yǎng)基中的外植體出芽數(shù)最高，平均達(dá)到3.25；4號(hào)培養(yǎng)基中外植體芽的生長(zhǎng)狀態(tài)最好。培養(yǎng)7 d后，9種培養(yǎng)基中的外植體均于切口處萌發(fā)側(cè)芽，使其出現(xiàn)了啟動(dòng)現(xiàn)象。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同培養(yǎng)基中的外植體芽生長(zhǎng)情況出現(xiàn)了差異。5號(hào)、6號(hào)培養(yǎng)基中莖段基部愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，叢生芽數(shù)量少，而4號(hào)培養(yǎng)基中莖段的腋芽著生處膨大變綠，在切口處形成少量的綠色愈傷組織；并在莖節(jié)或莖尖端緊靠莖節(jié)上、下的部位分化出側(cè)芽，且生長(zhǎng)旺盛；14 d形成叢生芽。

結(jié)合正交試驗(yàn)分析結(jié)果及外植體芽誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況，4號(hào)培養(yǎng)基的激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，為懷牛膝外植體芽誘導(dǎo)的最佳激素配比方案。

2.2 叢生芽增殖的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響懷牛膝叢生芽誘導(dǎo)分化的主要因素是6-BA，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6-BA 3個(gè)不同濃度梯度的增殖培養(yǎng)基。將懷牛膝單芽接種至3種不同的增殖培養(yǎng)基中，觀察叢生芽的增殖及生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖

系數(shù)及株高，比較不同6-BA濃度對(duì)叢生芽增殖的影響（表6）。結(jié)果表明，在Z2培養(yǎng)基中，即添加1.3 mg/L 6-BA時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)最高，平均為6.03，叢生芽生長(zhǎng)最快，且植株總體生長(zhǎng)狀況最佳，整體表現(xiàn)均勻、壯實(shí)，植株株高達(dá)4.12 cm（圖2）。培養(yǎng)基6-BA濃度增加1.5 mg/L或濃度減少至1.0 mg/L，叢生芽增殖系數(shù)和株高均偏低，且3種不同濃度的6-BA誘導(dǎo)叢生芽增殖的效果差異顯著。牛膝叢生芽增殖最適的6-BA濃度為1.3 mg/L，最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基為Z2，即MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。

2.3 誘導(dǎo)生根的優(yōu)化

選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致、高3～5 cm的叢生芽接入4種不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。7 d可見(jiàn)根已長(zhǎng)出，11 d根長(zhǎng)可達(dá)約5 cm，根數(shù)最多達(dá)到8條，單芽長(zhǎng)高變大，逐漸長(zhǎng)成苗。從表7可以看出，在1/2 MS培養(yǎng)基中添加一定濃度的NAA或IBA都可以誘導(dǎo)懷牛膝叢生芽生根，但不同激素種類和濃度對(duì)生根誘導(dǎo)的影響不同（圖3）。多重比較分析結(jié)果顯示，4種不同生根培養(yǎng)基中叢生芽的根長(zhǎng)、平均生根數(shù)、生根率均存在顯著差異。整體來(lái)看，在添加NAA的G1、G2培養(yǎng)基中，懷牛膝叢生芽生根速度慢，根粗且短，生根率低；而在添加IBA的G3、G4培養(yǎng)基中，叢生芽生根速度較快，生根率較高。在G4培養(yǎng)基中生根效果最好，生根率最高，為95.1%，并且生根速度快，根多而長(zhǎng)，粗細(xì)適中。所以，懷牛膝叢生芽誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為G4培養(yǎng)基，即1/2 MS+0.5 mg/L IBA。

2.4 組培苗練苗移栽的優(yōu)化

懷牛膝生根苗經(jīng)過(guò)練苗4 d后移栽至4種基質(zhì)中，比較在不同的基質(zhì)中組培苗的生長(zhǎng)情況，結(jié)果（表8）表明，懷牛膝的生根苗移栽至草炭灰 ∶ 營(yíng)養(yǎng)土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質(zhì)中成活率最高，達(dá)100%，且15 d后幼苗長(zhǎng)出新葉（圖4），植株壯實(shí)。

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞的分裂、分化產(chǎn)生影響。一定濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)與增殖發(fā)揮著重要作用。不同激素濃度組合的正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果表明，3種激素對(duì)于叢生芽誘導(dǎo)的影響從強(qiáng)到弱依次為6-BA>IBA>KT，3種激素最優(yōu)水平的組合是A2B1C2。以此激素組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)懷牛膝外植體出芽數(shù)最多，平均值達(dá)3.25，并且外植體芽生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)好，綜合正交試驗(yàn)結(jié)果和外植體芽的誘導(dǎo)分化，篩選出懷牛膝外植體芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素6-BA在叢生芽誘導(dǎo)中最為重要，它可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，使芽分化，促進(jìn)萌發(fā)[8]，特別是與一定濃度的生長(zhǎng)素協(xié)同作用時(shí)會(huì)加速細(xì)胞分裂，加快叢生芽分化生長(zhǎng)的速度。增加6-BA濃度，外植體的出芽數(shù)會(huì)增加，但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，外植體的出芽數(shù)呈減少的趨勢(shì)，外植體芽的誘導(dǎo)受到了抑制，本結(jié)論與劉堅(jiān)等的研究結(jié)果[9]一致，可能與試驗(yàn)材料自身生理特性及細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的交互作用有關(guān)[10]。在叢生芽增殖誘導(dǎo)中，設(shè)計(jì)6-BA的3個(gè)濃度梯度[11]，獲得最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，增殖系數(shù)最高達(dá)6.03。

生根過(guò)程起始于莖內(nèi)已分化潛伏的根原基，研究表明，生長(zhǎng)素IBA和NAA對(duì)根的形成均發(fā)揮著重要作用。IBA可以促進(jìn)根原基的產(chǎn)生，激活不定根[12]，加快不定根生長(zhǎng)的速度，且形成的不定根細(xì)而長(zhǎng)，在根與莖之間連接緊密，有利于組培苗大范圍吸收營(yíng)養(yǎng)及水分。而NAA作用機(jī)理主要是為根的形成提供能源和碳源。通過(guò)不同濃度IBA、NAA的對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IBA在生根速度、生根條數(shù)及生根率上均優(yōu)于NAA。生根培養(yǎng)以培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，達(dá)95.1%，且每株組培苗平均生根數(shù)約為8條。

栽培基質(zhì)是組培苗移栽成活的基礎(chǔ)，在保水性能好且通風(fēng)透氣的栽培基質(zhì)中，組培苗成活率較高[13]。通過(guò)不同基質(zhì)的配比試驗(yàn)得出練苗后置于草炭灰 ∶ 營(yíng)養(yǎng)土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質(zhì)中，組培苗成活率可以達(dá)到100%，且植株生長(zhǎng)健壯。

本研究從外植體芽誘導(dǎo)、叢生芽增殖、叢生芽生根、組培苗練苗移栽4個(gè)階段優(yōu)化懷牛膝組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，整體提高組培效率，為實(shí)現(xiàn)懷牛膝工廠化快速繁育奠定基礎(chǔ)。

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