程玉，薛晶，次云哲，紀(jì)海茹,鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

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·臨床研究·

Oct4和 PI3K在胃癌組織中的表達(dá)變化及意義

程玉，薛晶，次云哲，紀(jì)海茹,鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

目的觀察八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Oct4)與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在胃癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 收集60例胃癌組織和25例正常胃組織，分別應(yīng)用Western blot和RT-PCR法檢測(cè)Oct4與PI3K蛋白和mRNA；分析Oct4、PI3K表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，以及胃癌組織中Oct4與PI3K表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果 Oct4、PI3K蛋白和mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于在正常胃組織(P均<0.01)。胃癌組織分化程度越低、浸潤(rùn)深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，Oct4、PI3K蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量越高(P均<0.05)。相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中Oct4、PI3K蛋白、mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.634、0.587,P均<0.05)。結(jié)論 Oct4、PI3K從基因和蛋白水平在胃癌組織中呈高表達(dá)，二者共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃癌；八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子；磷脂酰肌醇3-激酶

近年來(lái)，胃癌在我國(guó)的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)，因此胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制成為了研究的熱點(diǎn)。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4蛋白(Oct4)是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一[1]，對(duì)細(xì)胞的正常分化起著決定性作用[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路的活化可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[3]。PI3K是存在于細(xì)胞質(zhì)的復(fù)合體，是磷脂激酶家族中的重要成員，在PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中是始動(dòng)因子[4]。目前，對(duì)于在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中Oct4和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用的研究報(bào)道較少。本研究檢測(cè)了正常胃組織與胃癌組織中Oct4、PI3K的表達(dá)，分析二者與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，從而探索胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，也為臨床治療胃癌提供潛在作用靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年7月～2014年2月手術(shù)切除的胃癌組織60例及癌旁正常胃組織25例，患者術(shù)前均未行化療、放療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為胃腺癌，相應(yīng)癌旁組織均未見(jiàn)累及?；颊咧心?5例、女15例，年齡(56±10.47)歲；病理組織高、中分化24例，低分化36例；癌組織侵及漿膜層48例，未侵及漿膜層12例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期32例。所有標(biāo)本離體后30 min內(nèi)儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱里，另一部分離體后立即于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.1.2主要試劑兔抗人一抗Oct4及PI3K抗體均購(gòu)自英國(guó)ABCOM公司，RIPA組織裂解液(BB120031)購(gòu)自上海貝博公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗及ECL超敏發(fā)光液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。cDNA合成試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，DNA Ladder試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。TRIzol 購(gòu)自Invitrogen公司，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。Oct4上游引物為5′- GTGCCGTGAAGCTGGAGAA-3′，下游引物5′-TGGTCGTTTGGCTGAATACCTT-3′；PI3K上游引物5′- TGCTATGCCTGCTCTGTAGTGGT-3′，下游引物5′-GTGTGACATTGAGG-GAGTCGTTG-3′;β-actin上游引物5′-AGCGGGAAA-TCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-ACATCTGCTGGAA-GGTGGAC-3′。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1Oct4、PI3K蛋白檢測(cè)采用Western blot法。稱(chēng)取適量胃癌組織及遠(yuǎn)端正常胃組織標(biāo)本(50～100 mg)，剪碎，加入約600 μL RIPA蛋白裂解液和5 μL PMSF蛋白保護(hù)液；4 ℃下12 000 r/min離心20 min后取上清，測(cè)定其中蛋白濃度。灌制5%的濃縮膠和12%的分離膠，每泳道加總蛋白量80 μg進(jìn)行電泳分離；在穩(wěn)流狀態(tài)下低溫轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中常溫封閉3 h。分別加入兔抗人Oct4及PI3K單克隆抗體(1∶10 000)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。10 min×3次TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。10 min×3次TBST洗膜后，顯影，定影。采用IPP圖像分析軟件，分別用Oct4、PI3K與β-actin灰度比值表示Oct4及PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2Oct4、PI3K基因檢測(cè)采用RT-PCR法。按TRIzol說(shuō)明書(shū)分別提取胃癌及正常胃組織總RNA，分別分析其完整性、濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳進(jìn)行定量檢測(cè)。采用IPP圖像分析軟件分析，分別用目的基因與內(nèi)參β-actin灰度比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　　　　胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與正常胃組織比較，*P<0.01。

2.2Oct4、PI3K蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Oct4、PI3K蛋白表達(dá)與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表3。

2.4Oct4、PI3K mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Oct4、PI3K mRNA的表達(dá)與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

2.5胃癌組織中Oct4、PI3K表達(dá)的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中Oct4與PI3K蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.634,P<0.05)，Oct4與PI3K mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.587,P<0.05)。

表2　　　　Oct4、PI3K蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表3　　　　胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常胃組織比較，*P<0.01。

表4　　　　Oct4、PI3K mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

Oct4 基因是八聚體核苷酸結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，早期發(fā)現(xiàn)于胚胎干細(xì)胞中[5,6]。人的Oct4蛋白屬于八聚體核苷酸結(jié)合蛋白家族第5類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，它在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、維持胚胎干細(xì)胞自我更新能力及定向分化能力方面具有重要作用[7]。除在胚胎和生殖細(xì)胞癌中表達(dá)外[8]，有研究者在乳腺癌MCF7細(xì)胞、肝癌Mahlava細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞等非生殖細(xì)胞及組織腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了Oct4的表達(dá)[9～12]。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織分化程度越低，Oct4的蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量越高，且在浸潤(rùn)深度侵及漿膜的胃癌組織中的表達(dá)高于于未侵及漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著胃癌惡性程度的增加，Oct4表達(dá)也是增高的。Oct4的高表達(dá)可能是胃癌干細(xì)胞擴(kuò)散的必須條件[13]。

PI3K是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的始動(dòng)因子，此信號(hào)通路是一條酪氨酸激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。Src、Ras、Rac、Ab1、v-Crk等具有酪氨酸激酶活性的癌性蛋白可與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合而發(fā)生作用，這些癌性蛋白的異?；罨杀籔I3K持續(xù)活化，引起細(xì)胞形態(tài)改變、凋亡受阻，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化及過(guò)度增殖[14]。PI3K還可以將具有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子Akt招募到質(zhì)膜上進(jìn)行活化，活化的Akt進(jìn)一步激活下游信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控[15]。本研究結(jié)果顯示，PI3K在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于遠(yuǎn)端正常組織，且隨著胃癌分化程度高、中、低變化，浸潤(rùn)深度由淺到深的改變，PI3K表達(dá)增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PI3K表達(dá)也明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示PI3K激活與胃癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。其機(jī)制可能是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抵抗Fas調(diào)節(jié)的凋亡中起重要作用[16]?；罨腜I3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，突破基底膜，促進(jìn)侵襲浸潤(rùn)[17]。

綜上所述，本研究從基因和蛋白水平證實(shí)了Oct4、PI3K在胃癌組織中高表達(dá)，并且二者的表達(dá)在胃癌組織中呈正相關(guān)，二者可能共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但目前對(duì)于腫瘤中OCT4與PI3K相互作用的具體機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

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河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(冀教高2013-4號(hào) )。

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B

1002-266X(2016)34-0027-03

2016-02-16)