周桂萍

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 廣州 510330）

UPLC-MS/MS同時(shí)測定水質(zhì)中諾氟沙星和氧氟沙星

周桂萍

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 廣州 510330）

建立了超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）同時(shí)測定水質(zhì)中諾氟沙星和氧氟沙星的分析方法。試樣經(jīng)HLB柱凈化和C18柱分離，采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，諾氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，空白樣品加標(biāo)回收率均大于85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，諾氟沙星和氧氟沙星方法檢出限（LOD）均為0.5 ng/mL，定量限為2 ng/mL。該方法準(zhǔn)確、靈敏、操作相對簡便，適用于同時(shí)測定水質(zhì)中諾氟沙星和氧氟沙星。

超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法；水質(zhì)；諾氟沙星；氧氟沙星

因此，本文建立固相萃取―超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水質(zhì)中氧氟沙星和諾氟沙星，具有靈敏度高、定性能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測，結(jié)果令人滿意。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1試劑與儀器

諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲酸，優(yōu)級純，德國CNW公司；氮?dú)?，純度大?9.999 %；超純水，18.2 M?。ACQUITYTM超高效液相色譜和Waters XevoTMTQ MS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器，美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，Waters公司；HLB固相萃取柱活化使用前均依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取氧氟沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為100 mg/L的儲備液。再用初始流動(dòng)相逐級稀釋配制2、10、25、50、75、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3HPLC-MS/MS檢測條件

色譜柱Shim-pack XR-ODS3 C18（75×2.0 mm，1.6 μm），柱溫40℃，流速0.2 mL/min，樣品室溫度15℃，流動(dòng)相A：0.1%甲酸―乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸―水，進(jìn)樣體積10 μL。

梯度洗脫程序：0～6 min，10%～60%A；6～11 min，60%A，保持5 min；11～11.1 min，60%～10%A。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），源溫度150℃，正離子掃描模和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量550 L/h，碰撞氣流量0.13 mL/min，毛細(xì)管電壓2.82 kV。

1.4樣品前處理

取水樣50 mL，過HLB柱凈化，樣品全部過柱后，抽干，用5 mL甲醇洗脫，35℃水浴氮?dú)獯抵两?，加?.0 mL0.2%甲酸―水溶液溶解，過0.45 μm濾膜，供液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件優(yōu)化

諾氟沙星和氧氟沙星屬于氟喹諾酮類抗生素，分子結(jié)構(gòu)式中含有哌嗪基和羧基，屬于酸堿兩性化合物，結(jié)構(gòu)中的羧基團(tuán)和叔胺基能在水中發(fā)生解離，液相色譜分析時(shí)易發(fā)生色譜峰拖尾現(xiàn)象，因固定相表面的活性位點(diǎn)（游離的硅醇基）可通過氫鍵等強(qiáng)烈吸附氧氟沙星和諾氟沙星。為保證待測物在流動(dòng)相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，本研究比較了在乙腈與3 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸等揮發(fā)性酸或揮發(fā)性鹽對待測物色譜行為的影響。結(jié)果表明，以0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式可獲得最優(yōu)的質(zhì)譜信號響應(yīng)，待測物雖然沒有完全分離，但并不影響定性定量。

2.2流量條件的選擇

對流量的選擇，對比了在0.2 mL/min～0.5 mL/min 流量范圍內(nèi)，諾氟沙星和氧氟沙星的質(zhì)譜信號響應(yīng)及色譜分離效果。結(jié)果表明，UPLC 在0.2 mL/min 流量下，分離效果、質(zhì)譜響應(yīng)值、色譜柱的柱壓以及分析時(shí)間均比較理想。

2.3質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

首先以流動(dòng)注射的方式將1 mg/L 的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)譜正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子，然后分別以分子離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描。由于諾氟沙星含有羧基和哌嗪結(jié)構(gòu)，在0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈流動(dòng)相條件下，容易獲得[M+H]+準(zhǔn)分子離子，通過改變碰撞能力和錐孔電壓，對準(zhǔn)分子離子碰撞，獲取子離子，定量離子選擇為豐度最強(qiáng)的碎片離子，定性離子選擇為次強(qiáng)碎片離子，獲得的最佳質(zhì)譜條件如表1所示。

表1　氧氟沙星和諾氟沙星保留時(shí)間及質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.4凈化條件的優(yōu)化

諾氟沙星和氧氟沙星屬于酸堿兩性化合物，具有較高的極性，能在水中發(fā)生解離。SPE柱中 HLB柱反相吸附劑具有親水親脂性且水可浸潤，是中性、酸性及堿性化合物的通用型小柱；WAX柱反相吸附劑為混合型弱陰離子，對強(qiáng)酸性化合物選擇性好。對比分析了 HLB柱和 WAX柱萃取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLB柱萃取效率較好，對諾氟沙星和氧氟沙星回收率為85.2%～89.4%，而 WAX柱平均回收率為55.2%～65.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，因此，本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取柱作為樣品凈化柱。

表2　諾氟沙星和氧氟沙星回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n＝6）

2.5線性范圍和檢出限

基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為對待測物的信號起抑制或增強(qiáng)作用，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。按照Matuszew ski等建立的數(shù)學(xué)模型，采用空白基質(zhì)提取后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法，考察基質(zhì)效應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)HLB柱凈化后，諾氟沙星和氧氟沙星未受到基質(zhì)抑制影響。

諾氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)0.998。以陰性水質(zhì)樣品作為本底，采用加標(biāo)的方式考察方法的定量限（LOQ）和檢出限（LOD）。結(jié)果表明，諾氟沙星和氧氟沙星在水質(zhì)中的檢出限（S/N≥3）為0.5 ng/mL，定量限（S/N≥10）為2 ng/mL。

2.6方法回收率與精密度

選擇不含待測物的水質(zhì)樣品分別添加2、5、10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品，按照“1.4”方法進(jìn)行測定，分別平行測定6次，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。諾氟沙星和氧氟沙星的回收率84.8%～94.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.8%～7.9%，準(zhǔn)確度和精密度好。

表3　諾氟沙星和氧氟沙星添加回收率和精密度（n＝6）

圖1a、圖1b分別為諾氟沙星空白樣品與空白樣品加標(biāo)（5 μg/L）的提取離子色譜圖，圖2a、圖2b分別為氧氟沙星空白樣品與空白樣品加標(biāo)（5 μg/L）的提取離子色譜圖，由圖1、圖2可見目標(biāo)物未受到雜質(zhì)干擾。

圖1　諾氟沙星空白樣品（a）和樣品加標(biāo)5 ng/mL（b）的MRM色譜圖

圖2　氧氟沙星空白樣品（a）和樣品加標(biāo)5 ng/mL（b）的MRM色譜圖

2.7實(shí)際樣品檢測

采用本方法對抽取的不同河涌各20份水質(zhì)樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)作質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的回收率等指標(biāo)均達(dá)到分析要求，13份水質(zhì)樣品均檢出諾氟沙星和氧氟沙星，諾氟沙星含量在15～64 ng/L，氧氟沙星含量在10～97 ng/L。

3　結(jié)論

建立了固相萃取―高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水質(zhì)中諾氟沙星和氧氟沙星的分析方法，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。樣品前處理簡單快速，凈化除雜效果好，有效降低基質(zhì)干擾，回收率高，適用于水質(zhì)中諾氟沙星和氧氟沙星的定量檢測與定性確證。

[1] 周德均, 李貴榮, 王永生. Al(Ⅲ) 增敏同步熒光-雙波長法測定牛奶中的諾氟沙星和氧氟沙星殘留[J]. 應(yīng)用化工, 2013, 42(1): 121-130.

[2] BaiY. The antibiotics abuse is still the persistent ailment[EB/OL]. (2008-11-12)[2016-01-18]. http://www.yybnet…com/ www/news/19/63289.html.

[3] Keun-Joo Choi, Sang-Goo Kim, Chang-won Kim, et a l. Determination of antibiotic compounds in water by on-line SPE-LC/MSD[J]. Chemosphere, 2007, 66(6): 977-984.

[4] Shao B, Chen D,Zhang J, et al. Determination of 76 pharmaceutical drugs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in slaughterhouse wastewater[J]. Chromatogr A, 2009, 1216(47): 8312- 8318.

[5] Ye Z Q, Weinberg H S, Meyer MT. Trace analysis of trimethoprim and sulfonamide, macrolide, quinolone, and tetracycline antibiotics in chlorinated drinking water using liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J]. Anal Chem, 2007, 79(3): 1135-1144.

[6] Benotti M J, Trenholm R A, Vanderford B J, et al. Pharmaceuticals and endocrine disrupting compounds in U.S. drinking water[J]. Environ Sci Technol, 2009, 43(3): 597-603.

[7] Stoob K, Singer H P, Stettler S, et al. Exhaustive extraction of sulfonamide antibiotics from aged agricultural soil using pressurized liquid extraction[J]. JChromatogr A, 2006, 1128: 1-9.

[8] Lillenberg M, Yurchenko S, Kipper K, et al. Simultaneous determination of fluoroquinolones, sulfonamides and tetracyclines in sewage sludge by pressurized liquid extraction and liquid chromatography electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(32): 5949-5954.

[9] Tang C M, Huang Q X, Yu Y Y, et a l. Multiresidue determination of sulfonamides, macrolides, trimethoprim, and chloramphenicol in sewage sludge and sediment using ultrasonic extraction coupled with solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Chem, 2009, 37(8): 1119-1124.

[10] Yang J F, Yinggg, Zhao J L, et al. Simultaneous determination of four classes of antibiotics in sediments of the Pearl Rivers using RRLC-MS/MS[J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(16): 3424-3432.

[11] 王碩, 張晶, 邵兵. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定污泥中氯霉素、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[J].分析測試學(xué)報(bào), 2013, 32(2): 179-185.

[12] 楊杰, 劉娜, 劉琪, 等. 量子點(diǎn)熒光免疫法快速測定氧氟沙星[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）, 2010(6): 541-545.

[13] 黃喜根, 李艷霞, 張恒松, 等. 化學(xué)計(jì)量學(xué)-分光光度法同時(shí)測定飼料中的諾氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星[J]. 分析試驗(yàn)室, 2011(6): 66-68.

[14] 李艷霞, 張恒松, 黃喜根, 等. 分光光度法同時(shí)測定血漿中的諾氟沙星和氧氟沙星[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 25: 10747-10749.

[15] Yi Y N, Lig R. Simultaneous determination of norfloxacinandlomefloxacin in milk by first derivative synchronousfluorescencespectrometry using Al (Ⅲ) as an enhancer[J]. Anal Chim Acta, 2011, 707(1/2): 128-134.

[16] See K L, Elbashir A A, Simultaneous determinationofofloxacin and ornidazole in pharmaceutical preparations bycapillary zone electrophoresis[J]. Biomed Chromatogr, 2009, 23(12): 1283-1290.

[17] 焦更生, 曹會(huì)蘭. 高效液相色譜法測定藥物制劑中諾氟沙星[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊, 2008(1): 88-89.

[18] 姜金慶, 李廣領(lǐng), 王自良, 等. 諾氟沙星免疫學(xué)檢測方法的建立及優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2011(21): 148-151.

[19] 范向明, 張艷, 何曉英. 離子液體修飾電極上氧氟沙星的電化學(xué)行為及測定[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010(8): 52-56.

Determination of Norfloxacin and Ofloxacin in Water Using UPLC-MS/MS

ZHOUgui-ping
（Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,guangzhou 510330, China）

An solid phase extraction and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water. The sample purified by HLB SPE column, and was separated on a reversed phase column by acetonitrile (containing 0.1% formic acid) and 0.1% formic acid solution and then detected by positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring (MRM) mode and liquid chromatography tandem mass spectrometry and then detected by UPLC-MS/MS under electrospray ionization, positive ion scan, multiple reaction monitoring (MRM) mode, fixed quantity with external standard. The results showed that Norfloxacin and Ofloxacin at 2～100 μg/L concentration ranged agood linear relationship, blank samples spike drecoveries weregreater than 85%, the relative standard deviation was less than 10%. Norfloxacin and Ofloxacin method detection limits (LOD) were all 0.5 ng/mL and 2 ng/mL, respectively. The method wasaccurate, sensitive, and the operation was relatively simple and effective to reduce matrix interference, suitable for determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water.

UPLC-MS/MS; water; Norfloxacin; Ofloxacin

O657.71; O657.8

A

1009-220X(2016)02-0037-06 DOI: 10.16560/j.cnki.gzhx.20160218諾氟沙星（Norfloxacin）和氧氟沙星（Ofloxacin）屬于氟喹諾酮類藥物。近年來，氟喹諾酮類藥物因有吸收好、血液濃度高、抗菌譜廣、半衰期長、能迅速分解到各組織等特點(diǎn)，在臨床和畜牧業(yè)中得到迅速推廣，成為用途廣泛、十分重要的抗生素[1]。據(jù)報(bào)道，僅2005年，我國生產(chǎn)抗生素約21萬噸，其中作為獸藥使用就有9萬噸[2]。這些藥物使用后經(jīng)不同途徑進(jìn)入環(huán)境，從而可能引發(fā)一系列問題，如細(xì)菌耐藥性等。目前在生活污水[3-4]、飲用水[5-6]、河流底泥、污泥[7-10]和土壤等多種環(huán)境中檢出了抗生素類藥物殘留[11]。國內(nèi)外對氧氟沙星和諾氟沙星的檢測方法主要有免疫法、分光光度法、熒光分析法、化學(xué)發(fā)光分析法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)分析法等[12-19]。這些方法存在一定的優(yōu)點(diǎn)，但都有定性能力差，檢出限高等不足，難以滿足水體中痕量抗生素的定性定量檢測。

2016-02-29

周桂萍（1984～），女，碩士學(xué)位，工程師；主要從事質(zhì)量管理與檢測技術(shù)研發(fā)。274257802 @qq.com