瞿葉輝， 丁利君， 彭文媛， 劉珊珊， 黃金， 成曉玲

(廣東工業(yè)大學(xué) 1.輕工化工學(xué)院；2.材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006)

?

響應(yīng)面優(yōu)化彈性蛋白酶酶解羅非魚下腳料的工藝研究

瞿葉輝1， 丁利君1， 彭文媛1， 劉珊珊1， 黃金2， 成曉玲1

(廣東工業(yè)大學(xué) 1.輕工化工學(xué)院；2.材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006)

以羅非魚加工魚片的下腳料魚頭、魚骨、魚尾等為原料，選用彈性蛋白酶對其水解，通過響應(yīng)面進(jìn)行分析并優(yōu)化酶解條件.以水解度與多肽含量為指標(biāo)，分別對酶濃度、溫度、pH值、料液比、酶解時間等因素對彈性蛋白酶酶解羅非魚下腳料水解效果的影響進(jìn)行分析.結(jié)果表明,彈性蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳條件為：酶濃度0.553mg/g，料液比1∶5、自然pH、溫度41.94 ℃、酶解3.31h，在此條件下得到的水解度為18.09%，多肽含量為0.9mg/mL.

羅非魚下腳料； 響應(yīng)面分析； 彈性蛋白酶； 水解度； 多肽含量

羅非魚屬鱸形目(Perciformes)麗鯛科(Cichlidae)羅非魚屬(Tilapia), 在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛養(yǎng)殖, 營養(yǎng)價值高，素有“白肉三文魚”、“21世紀(jì)的魚”之稱[1].中國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量世界第一,2010年的產(chǎn)量達(dá)120萬t，而全球羅非魚產(chǎn)量接近300萬t. 廣東省是國內(nèi)羅非魚養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量及出口量最高的省份[2].近年來隨著我國羅非魚魚片的出口數(shù)量迅速上升,大量的羅非魚下腳料隨之產(chǎn)生，幾乎占整條羅非魚的54%,其中魚頭、內(nèi)臟、魚鱗、魚骨和魚皮分別占26.5%、6.8%、2.2%、16.5%和4.0%，而這些原料富含氨基酸、蛋白質(zhì)和各種活性礦物質(zhì)，可作為人類可利用的蛋白源和營養(yǎng)源[3-4].近幾年來，國內(nèi)外有不少對魚類加工下腳料的綜合利用的研究探討，主要為通過酶法提取蛋白水解產(chǎn)物，積累了大量的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，為綜合利用開辟了新的途徑[5-6].用酶水解的水產(chǎn)動物蛋白多肽用途廣泛，需求量較大，市場前景廣闊，因此對多肽的研究具有十分重要的意義，而魚的下腳料及低值魚為理想的優(yōu)質(zhì)蛋白來源，可用來做為水解蛋白多肽的原料[7-8].利用蛋白酶對羅非魚下腳料進(jìn)行水解的研究較多，主要是魚鱗、魚骨、魚皮等，丁利君等人[9]用枯草桿菌蛋白酶酶解羅非魚魚糜，取得了很好的效果，曾世祥等人[10]篩選不同酶酶解羅非魚下腳料，得到木瓜蛋白酶的酶解效果最好.本研究以羅非魚下腳料為原料，選用彈性蛋白酶對其進(jìn)行酶解，并利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化酶解工藝，為羅非魚下腳料的綜合利用提供了理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚下腳料(魚頭、魚骨、魚尾等)，深圳聯(lián)合水產(chǎn)發(fā)展有限公司提供；彈性蛋白酶(30U/mg)，南京奧多福尼生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司；濃硫酸，硼酸，鹽酸，磷酸二氫鈉，三氯乙酸，磷酸氫二鈉，甲醛，百里酚酞，乙酸鎂，氫氧化鈉，中性紅，無水乙醚等，均為分析純.UV-1200型分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司.

1.2羅非魚下腳料基本成分分析

(1) 水分含量測定：恒溫干燥法(GB5009.3-2010).

(2) 脂肪含量測定：索士提取法(GB5009.6-2003).

(3) 蛋白質(zhì)含量測定：凱氏定氮法(GB5009.5-2010).

(4) 灰分的測定：灰化法(GB5009.4-2010).

1.3水解度及多肽含量的測定

1.3.1水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法[11-12].

式中,V1為空白消耗NaOH溶液的體積(mL)；V2為滴定樣品時消耗的NaOH溶液的體積(mL)；C為NaOH溶液的濃度(mol/L)；M為所取水解液的體積(mL).

1.3.2多肽含量的測定

參考魯偉[13]、ChalamaiahM[14]等人的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定多肽含量.由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y=0.114X+0.003 216， R2=0.994.

1.4羅非魚下腳料的酶解工藝

羅非魚下腳料→清洗預(yù)處理→粉碎→高壓蒸煮→彈性蛋白酶酶解→滅酶→離心→上清液.

1.5酶解條件的確定

選取酶濃度、酶解時間、酶解溫度、pH、料液比5個單因素，以水解度與多肽含量為考察指標(biāo)，確定對酶解效果較顯著的因素及水平.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken-Design響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，以水解度及多肽含量為響應(yīng)值[15].

2　結(jié)果與分析

2.1羅非魚下腳料基本成分分析

由表1可知，新鮮羅非魚加工下腳料含有大量水分，達(dá)50.89%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量高達(dá)23.10%，說明羅非魚下腳料是一種不可忽視的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，可應(yīng)用于多肽產(chǎn)品的開發(fā)及利用.

表1　羅非魚下腳料成分分析

2.2酶解羅非魚下腳料的單因素試驗(yàn)

2.2.1酶濃度對酶解效果的影響

稱取羅非魚下腳料樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，然后分別配制0、10、20、30、50、70、100U/g7個梯度的酶溶液，在pH值7.8、溫度25 ℃、料液比1∶5的條件下酶解2h，以水解度(DH)和多肽含量(PC)為指標(biāo)，探討不同酶濃度對酶解效果的影響.圖1表明，當(dāng)酶濃度從0到20U/g時，水解度與多肽濃度上升速度非常快，隨著酶濃度的增加，水解度變化不大，多肽含量呈現(xiàn)下降的趨勢.

圖1　酶濃度對酶解效果的影響

2.2.2酶解時間對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，在酶濃度20U/g、pH值7.8、溫度25 ℃、料液比1∶5的條件下，分別酶解0、1、2、3、5、7、10h，分析不同酶解時間對酶解效果的影響.從圖2可看出，隨著酶解時間的增加，在0～2h范圍內(nèi)，水解度和多肽含量均有所上升，當(dāng)酶解時間超過2h后，多肽含量呈現(xiàn)稍微下降的趨勢，而水解度在2h時達(dá)到最大值并趨于平衡.

圖2　酶解時間對酶解效果的影響

2.2.3酶解溫度對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、pH值7.8、料液比1∶5為固定條件，分別在室溫(22 ℃)、5、15、25、35、45、55 ℃的條件下酶解2h分析不同酶解溫度對酶解效果的影響.從圖3可知，在5～35 ℃范圍內(nèi)，水解度與多肽含量隨著溫度的升高而逐漸升高，當(dāng)溫度為45 ℃時，水解度達(dá)到最大，溫度在35～55 ℃時，多肽含量較高且穩(wěn)定.

圖3　酶解溫度對酶解效果的影響

2.2.4pH對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、溫度25 ℃、料液比1∶5為固定條件，分別在pH為自然(7.3)、4、5、6、7、8、9的條件下酶解2h，研究不同pH環(huán)境對酶解效果的影響.由圖4可以看出，隨著初始pH值的增加，水解度和多肽含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在自然pH時達(dá)到最大.

圖4　pH對酶解效果的影響

2.2.5料液比對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、溫度25 ℃、自然pH為固定條件，分別在料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10的條件下酶解2h，探討不同料液比對酶解效果的影響.圖5表明，隨著料液比的增大，對酶解效果影響不大，慮到能源以及經(jīng)濟(jì)等因素，選擇1∶5的料液比作為酶解條件的最優(yōu)料液比.

圖5　料液比對酶解效果的影響

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶濃度、溫度、時間對酶解效果有顯著影響的因素，進(jìn)行Box-Behnken-Design響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，如表2，并獲得試驗(yàn)結(jié)果如表3.采用Design-Expert對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(ANOVA)，利用Design-Expert8.0.6軟件對表3的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到響應(yīng)的回歸方程為：

水解度=-6.456 15+0.867 48A+4.359 39B+0.237 72C+ 0.004 926 81AB-0.004 347 9AC+0.148 99BC-0.017 562A2-1.550 66B2-0.005 880 44C2，R2=0.978 1.

多肽含量=-4.155 73+0.071 886A+0.938 93B+0.152 36C +0.006 761AB -0.001 375AC-0.005 998 7BC-0.001 302A2-0.124 28B2-0.001 418 5C2，R2=0.9915.

方差分析結(jié)果(見表4)表明，以水解度為指標(biāo)，模型P值小于0.000 1，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.4178>0.05，而以多肽含量為指標(biāo)，模型P值小于0.000 1，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.1163>0.05，說明模型與實(shí)際情況擬合情況良好，可以使用該模型對實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測和分析.影響酶解液中水解度的因素順序?yàn)椋簻囟菴>時間B>酶濃度A；酶濃度、時間、溫度對酶解液中多肽濃度的都較大，其中A、C的交互作用最為明顯.

表2　響應(yīng)面因素水平表

表3　響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析1)

1) 當(dāng)P<0.01時高度顯著，標(biāo)記為**，當(dāng)0.010.05時不顯著，標(biāo)記為-

由圖6可看出酶濃度、酶解時間、酶解溫度三者之間的交互關(guān)系.其中時間與酶濃度、酶濃度與溫度之間的交互關(guān)系不是特別顯著，表現(xiàn)為曲面較平緩，時間與溫度的交互關(guān)系比較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡.當(dāng)酶濃度小于16.87U/g，水解度隨著酶濃度的升高而增大，隨著酶濃度繼續(xù)增加，水解度幾乎不發(fā)生變化.當(dāng)溫度固定時，時間對水解度的影響比較顯著，呈先升后降的趨勢，當(dāng)溫度固定在41.9 ℃時，3.3h時水解度達(dá)到最大值.

圖6　各因素對酶解羅非魚下腳料水解度的影響

Fig.6InfluenceofdifferentfactorsonthedegreeofhydrolysisofTilapiawaste

圖7可看出酶濃度、溫度、時間三者之間的交互關(guān)系.其中時間與酶濃度、酶濃度與溫度、時間與溫度的交互關(guān)系都比較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，其中酶濃度與溫度的交互關(guān)系最為顯著，這與表4中各因素交互的P值相對應(yīng)(PAB=0.001 3，PAC<0.000 1，PBC=0.002 6).在AB的交互作用中，多肽濃度隨著酶濃度的升高而增大，隨著酶濃度繼續(xù)增加，多肽濃度幾乎不發(fā)生變化.在AC的交互作用中，當(dāng)酶濃度固定時，溫度對水解度的影響比較顯著，呈先升后降的趨勢.在BC的交互作用中，酶濃度固定時，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度和時間的變化對多肽濃度的影響不是特別顯著.

3　結(jié)論

由回歸方程預(yù)測因素水平內(nèi)的最佳酶解工藝為：酶濃度16.87U/g(即0.553mg/g)，料液比1∶5、自然pH、溫度41.94 ℃、酶解3.31h.在此酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解度為18.09%，多肽含量為0.9mg/mL，證明此模型是可靠有效的.

圖7　各因素對酶解羅非魚下腳料多肽含量的影響

Fig.7InfluenceofdifferentfactorsonthepeptidecontentofTilapiawaste

采用彈性蛋白酶對羅非魚加工下腳料進(jìn)行酶解，可以制備富含多肽的酶解液.研究結(jié)果對羅非魚加工下腳料的開發(fā)利用有一定的參考價值.

[1] 鞏育軍, 郭先霞, 李瑞偉, 等. 羅非魚營養(yǎng)成分研究進(jìn)展[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2009 (11):50-52.

[2] 曾慶孝,朱志偉.廣東省羅非魚加工業(yè)分析[J]. 水產(chǎn)科技,2005 (4): 1-5.

[3] 劉華, 趙利, 范艷, 等. 魚下腳料綜合利用研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2014 (4) :60-62.

LIUH,ZHAOL,FANY,etal.Comprehensiveutilizationoffishprocessrefuge[J].AcademicPeriodicalofFarmProductsProcessing, 2014 (4): 60-62.

[4]SILVAJFX,RIBEIROK,SILVAJF,etal.Utilizationoftilapiaprocessingwastefortheproductionoffishproteinhydrolysate[J].AnimalFeedScienceandTechnology, 2014 (196): 96-106.

[5]TAKESHINAGAI,NOBUTAKASUZUKI.Isolationofcollagenfromfishwastematerial-skin,boneandfins[J].FoodChemistry, 2000 (68): 277-281.

[6] 胡立新,程驕,占穩(wěn),等. 魚下腳料中膠原蛋白的提取與應(yīng)用[J]. 化學(xué)與生物工程, 2009, 26 (2) :7-9.

HULX,CHENGJ,ZHANW,etal.Extractionandapplicationofcollageninthefishwaste[J].ChemistryandBioengineering, 2009, 26 (2): 7-9.

[7]CHALAMAIAHM,DINESHKUMARB,HEMALATHAR,etal.Fishproteinhydrolysates:Proximatecomposition,aminoacidcomposition,antioxidantactivitiesandapplications:Areview[J].FoodChemistry, 2012 (135): 3020-3038.

[8] 陳勝軍, 曾名勇, 董士遠(yuǎn). 水產(chǎn)膠原蛋白及其活性肽的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2004, 23 (6): 40-46.

CHENSJ,ZENGMY,DONGSY.Progressinthestudyofcollagenandactivepeptideofeisheries[J].FisheriesScience, 2004, 23(6): 40-46.

[9] 丁利君, 黃小梅, 何穎基. 羅非魚蛋白制取多肽酶解條件的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2008, 24(2): 15-18.

DINGLJ,HUANGXM,HEYJ.Optimizationofhydrolysisconditionsforpeptidesproducingfromtilapiaprotein[J].FoodMachinery, 2008, 24 (2) :15-18.

[10] 曾世祥, 韋保耀, 滕建文,等. 羅非魚下腳料酶法水解條件優(yōu)化的研究[J]. 食品科技,2005 (11) :78-81.

ZENGSX,WEIBY,TENGJW,etal.Studyonoptimizedconditionsoftilapiaheelsbyenzymaticmethods[J].FoodScienceandTechnology, 2005 (11): 78-81.

[11] 楊文博, 張英華. 蛋白質(zhì)水解度的測定方法研究[J]. 中國調(diào)味品, 2014, 39 (3): 88-90.

YANGWB,ZHANGYH.Studyonthedeterminationmethodsforhydrolysisdegreeofprotein[J].ChinaCondiment, 2014, 39 (3) : 88-90.

[12]SUTHASIAEEN,SITTIWATL．Optimizationofenzymatichydrolysisoffishsolubleconcentratebycommercialproteases[J].JournalofFoodEngineering, 2005 (70): 571-57.

[13] 魯偉, 任國譜, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J]. 食品科學(xué), 2005, 26 (7) :169-171.

LUW，RENGP,SONGJM.Determinationofcontentofpeptidesinproteinhydrolysates[J].FoodScience, 2005, 26 (7): 169-171.

[14]INESJ,MOURADJ,RIMN,etal.Functional,antioxidantandantibacterialpropertiesOfproteinhydrolysatespreparedfromfishmeatFermentedbyBacillus subtilisA26[J].ProcessBiochemistry, 2014 (49): 963-972.

[15] 張衛(wèi)麗,韓雅麗.響應(yīng)面法優(yōu)化馬尾松松針中總黃酮提取工藝[J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 30 (1) : 115-119.

ZHANGWL,HANYL.Theextractionprocessofpinusmassonianaoptimizedbyresponsesurface[J].JournalofGuangdongUniversityofTechnology, 2013, 30 (1): 115-119.

Optimization of Enzymolysis of Tilapia Waste with Response Surface Methodology by Elastase

Qu Ye-hui1, Ding Li-jun1, Peng Wen-yuan1, Liu Shan-shan1, Huang Jin2, Cheng Xiao-ling1

(1.School of Chemical Engineering and Light Industry; 2. School of Materials and Energy,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Thehead,bones,andotherrawwasteofTilapiaarehydrolyzedbyelastase,andresponsesurfaceanalysismethodisusedtooptimizetheenzymaticprocesses.Theenzymeconcentration,temperature,pH,solidtoliquidratio,timeandotherfactorsarediscussedtoanalyzetheeffectofhydrolysisbasedonthedegreeofhydrolysisandpeptidecontent.Theresultsshowthattheoptimumconditionsofelastasehydrolysis:enzymeconcentration0.553mg/g,temperature41.94 ℃,time3.31h,pHnatural,solid-liquidratio1∶5,thedegreeofhydrolysisandthepeptidecontentisseparately18.09%and0.90mg/mlinthiscondition.

Tilapiawaste;responsesurfacemethodology;elastase；hydrolysis;peptide

2015- 10- 20

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研合作重大專項(xiàng)(2013A090100009).

瞿葉輝(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭称芳庸?

丁利君(1965-)，女，教授，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與天然產(chǎn)物化學(xué).E-mail:ddddlj@foxmail.com

10.3969/j.issn.1007- 7162.2016.05.014

TS254.9

A

1007-7162(2016)05- 0077- 06