吳西軍 董智慧 舒莉萍 何志旭 ，3

（1貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心 貴州 貴陽 550004）

（2貴州醫(yī)科大學免疫學教研室 貴州 貴陽 550004）

（3貴州省兒童醫(yī)學中心 貴州 貴陽 550004）

人EC-SOD基因真核表達載體的構建與鑒定

吳西軍1，2董智慧1舒莉萍1，2何志旭1，3

（1貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心 貴州 貴陽 550004）

（2貴州醫(yī)科大學免疫學教研室 貴州 貴陽 550004）

（3貴州省兒童醫(yī)學中心 貴州 貴陽 550004）

目的：構建攜帶EC-SOD基因和增強綠色熒光蛋白（EGFP)報告基因的真核表達載體，并觀察其在人臍帶間充質干細胞（huMSCs）細胞中的表達。方法：從人外周血中提取總RNA,逆轉率制備cDNA,采用聚合酶鏈式反應（PCR）中獲取EC-SOD基因，其與真核表達載體pCS2+經(jīng)ClaI/EcoRI雙酶切后；經(jīng)T4 DNA連接酶連接，獲得重組質粒pCS2+-EC-SOD，用菌液PCR、ClaI/EcoRI雙酶切及測序鑒定正確后，將其與經(jīng)PCR獲取的EGFP基因用EcoRI/xbaI雙酶切；經(jīng)T4 DNA連接酶連接，獲得pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質粒，用菌落 PCR、EcoRI/xbaI雙酶切及測序鑒定。用納米試劑法轉染huMSCs細胞，用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達。結果：成功獲取了EC-SOD基因和EGFP基因，重組質粒pCS2+-ECSOD-EGFP經(jīng)菌落PCR和雙酶切均得到大小一致的目的條帶，經(jīng)測序鑒定該序列與GenBank中人EC-SOD基因、EGFP基因序列的同源性達100%，基因插入方向正確；重組質粒轉染huMSCs細胞后可見EGFP增強綠色熒光蛋白表達。結論：成功構建了EC-SOD的真核表達重組質粒pCS2+-EC-SOD-EGFP，且能在huMSCs細胞中表達 。

EC-SOD基因；增強綠色熒光蛋白；表達載體；轉染

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases，SOD)是機體內一種重要的抗氧化酶，其功能是清除細胞生命活動中產(chǎn)生的超氧離子。在哺乳動物SOD共有三種亞型：Mn-SOD存在于線粒體，Cu／Zn.SOD主要位于細胞質和細胞核。細胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD，EC-SOD)是唯一位于細胞外的SOD亞型，通過其肝素結合結構域(heparin.binding domain，HBD)與細胞表面和細胞外基質相結合，主要存在于是細胞外體液，如淋巴液、滑膜液及血漿中，擔負著這些部位艱巨的清除超氧化物的作用[1]，這些特性為其在健康領域中的應用提供了廣闊的前景。本研究通過構建重組的真核表達質粒pCS2+-EC-SOD-EGFP，并且在并將其在人臍帶間充質干細胞中表達，為進一步研究干細胞聯(lián)合EC-SOD在抗衰老中的作用奠定基礎。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

人臍帶間充質干細胞、pCS2+載體質粒、E.coliDH50α由貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心細胞庫保存，PCR引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成，Trizol試劑、逆轉錄試 劑First.strand plus購自Invitrogen公司，高保真KOD—Plus FCR酶購自TOYOBO公司，限制性內切酶Cal1、EecR I和Xba I、T4 DNA連接酶以及均購自Fermentas公司，質粒小抽 試劑盒購自于Axygen公司。DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生物公司，基因鑒定測序由北京諾賽基因公司完成。DMEM培養(yǎng)液、0.25% 胰蛋白酶購自美國Hyclohe公司，胎牛血清購自杭州四季青生物制品有限公司，納米轉染試劑由xxx公司惠贈，外周血來源于本人捐獻。

1.2 實驗方法

（1）總RNA的提取及目的基因的獲取 抽取外周血勻漿，參照Trizol Total RNA說明書，采用一步法提取人外周血總RNA后再逆轉錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。在NCBI pubmed的Genebank數(shù)據(jù)庫中查找到目的基因EC-SOD（登錄號為：NM-003102.2）以及EGFP（登錄號：NC-013179.1）編碼序列的ORF，參照pCS2+質粒的多克隆位點，用NCBI ORF及DNAMAN軟件各自對其進行ORF分析，限制性酶切分析。根據(jù)實驗目的再用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計不含EC-SOD終止子及EGFP啟動子的特異性引物：

表1 ec-sod、egfp基因引物

擴增條件為：94℃預變性2min，94℃變性30S；55/62℃退火30S，68℃延伸1min，共30次循環(huán)，最后延伸68℃10min，PCR產(chǎn)物大小為720/717bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

（2） pCS2+-EC-SOD-EGFP表達載體構建及鑒定

EC-SOD基因PCR產(chǎn)物和pCS2+載體分別用限制性內切酶Cal I和EcoR1進行雙酶切酶切并割膠回收。通過T4連接酶將EC-SOD和pCS2+載體重組連接，轉化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)篩選后挑取單克隆，搖菌，質粒小提試劑盒抽取質粒DNA。用限制性內切酶Cal I和EcoR1進行雙酶切和菌液PCR驗證，正確后送往京賽諾公司進行序列測定并進行Blast比對。將驗證正確的重組質粒EC-SOD-pCS2+和EGFP基因片段用限制性內切酶EcoR1和Xba I進行雙酶切并割膠回收。通過T4連接后轉化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)篩選后挑取單克隆，搖菌并質粒小提試劑盒抽取質粒DNA。用限制性內切酶Cal I和EcoR1進行雙酶切和菌液PCR驗證，正確后送往京賽諾公司進行序列測定并進行Blast比對。

（3）人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)及重組質粒pCS2+-EC-SOD-EGFP轉染 人臍帶間充質干細胞的復蘇后加入含10%FBS的低糖DMEM，將其轉移至培養(yǎng)瓶中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（CO2濃度為5%，溫度為37℃），傳代后待細胞長至70%左右時，將構建好的重組質粒EC-SOD-EGFP-pCS2+與轉染試劑直接混合，震蕩混勻制備核酸-納米混合物，將核酸-納米混合物加入細胞培養(yǎng)板中，輕柔混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，24小時換液，48小時后熒光顯微鏡下觀察EC-SOD-EGFP融合蛋白的表達情況。

2.結果

2.1 EC-SOD-pCS2+重組質粒的構建

（1）外周血總RNA提取 從人外周血中提取出EC-SOD總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳檢測，兩個樣本條帶清晰，均可見28s、18s、5s條帶(如圖1)。

圖1 人外周血總RNA電泳圖

（2） EC-SOD目的基因RT-PCR擴增 以cDNA為模版，用設計合成的引物SOD3的上游引物和下游引物進行PCR擴增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結果顯示，三個樣本在與700bp大致平行處均有明亮的條帶，與預期條帶大小一致(如圖2)。

圖2 EC-SOD基因PCR擴增電泳圖(1、DNA markerⅤ；2、EC-SOD PCR產(chǎn)物）

（3）SOD3-pCS2+重組質粒酶切鑒定結果 將SOD3-pCS2+質粒以EcoRI及ClaI雙酶切，EcoRI單酶切，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結果顯示，在4000bp附近有兩條帶，700bp附近有一條帶，條帶大小與目標條帶大小相符，可初步鑒定有目的基因插入pCS2+質粒DNA。

圖3 pCS2+-EC-SOD重組質粒酶切鑒定電泳圖（M、DNA makerⅣ；1、pCS2+-EC-SOD重組質粒ClaI 和 EcoRI 雙酶切；2、pCS2+-EC-SOD重組質粒 EcoRI 單酶切）

（4）SOD3-pCS2+重組質粒菌落PCR結果 挑取陽性克隆菌落培養(yǎng)，取4個質粒DNA菌液裂解，以其為模版，進行菌落PCR檢測，根據(jù)電泳結果，在700bp上方有明顯條帶，與目的基大小相符，說明這單克隆菌落中有目的基因存在(如圖4)。

圖4 EC-SOD基因菌落PCR結果電泳圖。(1、DNA markerⅤ；2、EC-SOD PCR產(chǎn)物；3、空白對照）

（5）測序結果 將重組質粒pCS2+-EC-SOD委托北京諾賽生物公司進行測序，其結果經(jīng)Genebank中EC-SOD進行序列比對，與r人EC-SOD基因序列完全一致，ATG起始可見，酶切位點存在（如圖5）。

圖5 EC-SOD測序結果圖（部分）

2.2 pCS2+-EC-SOD-EGFP 重組質粒的構建

（1）EGFP基因PCR結果 以中心保存的含有EGFP整個編碼序列的質粒為模版，PCR擴增后獲得不含ATG起始的EGFP序列的PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳結果可見，在位于700bp附近可見一明顯條帶，與預期733bp大小相符（如圖6）。

圖6 EGFP基因PCR結果（1、DNA markerⅤ；2、EGFP PCR產(chǎn)物；3、空白對照）

（2）pCS2+EC-SOD-EGFP重組質粒酶切鑒定 將SOD3-egfp-pCS2+重組質粒以EorRI 及XbaI 雙酶切，XbaI單酶切鑒定，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在5500bp附近有兩條帶，700bp附近可見一條明顯的條帶，大小與預期的相符，初步判斷egfp已經(jīng)插入（如圖7）

圖7 EC-SOD-EGFP-pCS2+重組質粒酶切結果電泳圖（M、DNA makerⅣ；1、pCS2+-EC-SOD重組質粒ClaI 和 EcoRI 雙酶切；2、pCS2+-EC-SOD重組質粒 EcoRI 單酶切）

（3）SOD3-egfp-pCS2+重組質粒菌落PCR 挑取SOD3-egfp-pCS2+重組質粒陽性克隆菌落培養(yǎng)，取6個質粒DNA菌液裂解，以其為模版，1個空白對照，進行菌落PCR擴增，根據(jù)電泳結果顯示，2號質粒濃度較低，3-7號泳道在700bp上方有明顯條帶，與目的基因大?。?23bp）相符，說明幾個菌落中皆有目的基因存在(如圖8)。

圖8 EGFP基因菌落PCR結果電泳圖（1、DNA Marker Ⅴ；2、EGFP PCR產(chǎn)物；3、空白）

（4）EGFP測序結果 將構建好的重組質粒委托北京諾賽生物公司進行測序，其結果經(jīng)Genebank中EGFP進行序列比對，與基因序列完全一致，酶切位點存在（如圖9）。

圖9 EGFP基因序列測定結果圖（部分）

2.3 pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質粒載體轉染人臍帶間充質干細胞

人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)至第五代培養(yǎng)板中細胞達70%左右時，加入制備好的轉染混懸液，48小時后熒光顯微鏡觀察，結果如圖10：

圖10 pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質粒轉染huMSCs 48小時后熒光顯微鏡下觀察（A1、B1為明場；A2、B2為熒光場；x100）

3.討論

外源蛋白在哺乳動物細胞中的表達受多種因素影響，比如：啟動子的強度、整合位置、轉錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性、mRNA的翻譯效率、目的蛋白的穩(wěn)定性、目的蛋白的折疊效率等其中重要因素均與表達載體的選擇有關[2]。所以表達載體的選擇是決定外源蛋白表達的關鍵，而啟動子的強度對于基因的表達尤其重要。本課題所選用的pCS2+載體，含有較強的啟動子，符合特定表達載體要求。EC-SOD基因和EGFP基因融合蛋白表達，要求我們在設計特異性引物時要注意EC-SOD基因的終止子和EGFP基因啟動子的特殊處理?？寺』颍迦胼d體，雙酶切及菌落PCR鑒定，序列測定并進行blast比對，找出引入的酶切位點，比對完全正確后在進行下步操作，保證所構建的重組表達質粒能夠保真，并利用納米轉染試劑轉染。

人的EC-SOD的基因位位于人染色體的4q21與牛及大鼠的EC-SOD基因和Cu/Zn-SOD的基因有60%的同源性。人EC-SOD的cDNA編碼30kD大小的亞基，是由240個氨基酸殘基組成的多肽，其中包含18個氨基酸組成的信號肽，因此成熟蛋白由222個氨基酸組成[1、3]。EC-SOD是一種輕微疏水的糖蛋白，主要存在于細胞外液和結締組織細胞外基質中。當機體受到射線照射、代謝物物聚集后會產(chǎn)生大量氧自由基及中間產(chǎn)物等活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其可以誘導產(chǎn)生促有絲分裂效應并參與細胞信號傳導[4-5]，但當ROS不斷增多，無法清除時，會損傷細胞內的蛋白質、脂類、核及線粒體的DNA。使細胞質和細胞核中的核酸鏈斷裂，導致腫瘤、炎癥、衰老、血液病及心、肝、肺、皮膚等部位產(chǎn)生病變[6-8]。SOD能夠有效清除氧自由基，從而起到保護機體細胞的作用。間充質干細胞是起源于中胚層的一類多能細胞，它具有以下特性自我更新，多向分化能力及較低的免疫原性讓其有較廣泛的應用前景。不同來源的間充質干細胞具有非常相似生物學特性[9-12]，正常生理情況下斷分化為新的間質細胞補充、替代老化的間質細胞和組織。所以補充外源性間充質干細胞是否能改善，甚至逆轉組織器官的衰老是一個很值得探究的研究熱點。將EC-SOD與間充質干細胞聯(lián)合抗衰老，既能清楚氧自由基代謝壓力和輻射老化，又能通過干細胞分泌相關細胞因子調節(jié)組織再生、調節(jié)免疫功能，兼顧內外因素抗衰老[13-17]，極具應用前景。

本項研究成功的構建了pCS2+-EC-SOD-EGFP重組真核表達質粒載體，經(jīng)去內毒素處理后通過納米試劑制備混懸液后轉染人臍帶間充質干細胞，轉然后48小時在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光蛋白的表達，由于構建的pCS2+-EC-SOD-EGFP重組真核表達質粒載體表達的是融合蛋白，必須在EC-SOD表達的情況下才可以繼續(xù)表達綠色熒光蛋白，可見重組表達構建和轉染是成功的。為進一步進行EC-SOD與間充質干細胞聯(lián)合抗衰老研究打下堅實基礎。

[1] Micha? Skrzycki, Hanna Czeczot，Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD)– structure,properties and functions，Postepy Hig Med Dosw.(online), 2004; 58:301-311.

[2] Abdul Mutalib NE，Matlsa N，Alitheeh NB，et al. IRESihcorporated lactococcal bicistrohic vector for target gehe expressioh ih a eukaryotic system[J]. Plasmid，2014（73）：26-33.

[3] Hjalmarsson K,Marklund S L,Engstrom A,et al.Isolation and sequence of complementary DNA encoding human extra2 cellular superoxide dismutase[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84: 6340-6344.

[4] Madamanchi N1L Moon SK，Hakim ZS，et a1.Differential activation of mitogenic signaling pathways in aortic smooth muscle cells deficient in superoxide dismutaseisoforms.Arterioscler Thromb Vase Biol，2005，25(5)：950-956.

[5] Poli G Leonarduzzi G Biasi F，et a1.Oxidative stress and cell signaling.Curr Med Chem，2004，11(9)：1163-1182.

[6] Perveen S,Patel H,Arif A,Younis S,Codipilly CN,et al.(2012)Role of EC-SOD Overexpression in Preserving Pulmonary Angiogenesis Inhibited by Oxidative Stress.PLoS ONE 7(12): e51945.

[7] Hirofumi Koyama,Hidetoshi Nojiri,Satoru Kawakami，et al.Antioxidants Improve the Phenotypes of Dilated Cardiomyopathy and Muscle Fatigue in Mitochondrial Superoxide Dismutase-Deficient Mice.Molecules 2013, 18, 1383-1393.

[8] Cassidy Delaney1,*,Rachel H. Wright1,Jen-Ruey Tang,et al.Lack of EC-SOD worsens alveolar and vascular development in a neonatal mouse model of bleomycin-

induced bronchopulmonary dysplasia and pulmonary hypertension.Pediatr Res.2015;78(6): 634-640.

[9] Bruder SP,Kurth AA,Shea M,et al.Bone regeneration by implantation of purified,culture-expanded human mesenchymal stem cells.J Orthop Res.1998;16(2):155-162.

[10] Kadiyala S,Young RG,Thiede MA,et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant. 1997;6(2):125-134.

[11] Dennis JE,Merriam A,Awadallah A,et al. A Quadripotential Mesenchymal Progenitor Cell Isolated from the Marrow of an Adult Mouse.J Bone Miner Res.1999;14(5):700-709.

[12] Ferrari G,Cusella G,Angelis D,et al. Muscle Regeneration by Bone Marrow-Derived Myogenic Progenitors. Science.1998;279(5356):1528-1530.

[13] Barbara L.Marshall The New Virility：Viagra,Male Aging and Sexual Function Sexualities，Jul 2006，9：345-362.

[14] Delminda Neves，Janete Santos，Nuno Tomada,Henrique Almeida,and Pedrovendeir Aging and Orchidectomy Modulate Expression of VEGF Receptors on Corpus Cavernosum of theat Ann.N.Y.Acad.Sci，2006，1067：164-172.

[15] S Ma,N Xie,W Li,B Yuan,Y Shi*,Immunobiology of mesenchymal stem cells.Cell Death and Differentiation 2014,21,216-225.

[16] Ying Wang,Xiaodong Chen,Yufang Shi,et al.Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation:pathological and therapeutic implications.Nature immunology，2014,15,11,1009-1016.

[17] Edward D.Levin.Extracellular Superoxide Dismutase(EC-SOD)Quenches Free Radicals and Attenuates Age-Related Cognitive Decline: Opportunities for Novel Drug Development in Aging.Current Alzheimer Research,2005,2,191-196.

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1009-5624（2016）05-0074-05