余佩佩,程 俊，顧 華，余肖峰，邵超英*

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；2.國(guó)土資源部上海資源環(huán)境監(jiān)督檢測(cè)中心，上海 200072)

熒光增白劑(Fluorescent Whitening Agents，F(xiàn)WAs)被廣泛用于紙制品、紡織品及洗滌劑等產(chǎn)品中以提高產(chǎn)品的白度和光澤度。有報(bào)道指出，使用含有熒光增白劑的洗滌液或紙制品，會(huì)導(dǎo)致皮膚上熒光增白劑的殘留[1,2]。這些熒光劑與人體中的蛋白質(zhì)結(jié)合，會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)、造成血液系統(tǒng)受損、甚至導(dǎo)致細(xì)胞變異，具有潛在的致癌性。因此，我國(guó)對(duì)紙制品、餐具洗滌劑等產(chǎn)品中熒光增白劑的使用進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)管，并制定了相關(guān)規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)[3,4]。然而，在日用護(hù)膚化妝品[5]及面膜[6]等產(chǎn)品的衛(wèi)生規(guī)范中均未明確禁止熒光增白劑的使用，也未出臺(tái)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。一些不良商家在美白面膜中惡意添加熒光增白劑，以達(dá)到一敷即白的效果，給人類健康帶來(lái)潛在威脅。因此，研究面膜等護(hù)膚產(chǎn)品中熒光增白劑的檢測(cè)方法，對(duì)相關(guān)機(jī)構(gòu)加強(qiáng)化妝品產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督管理和保障消費(fèi)者身體健康具有重要意義。

目前，熒光增白劑的檢測(cè)方法主要有紫外燈照射觀測(cè)法[7]、熒光分光光度法[8]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)(HPLC-FLD)法[9 - 11]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[12 - 14]等。其中，紫外燈照射觀測(cè)法僅限于熒光劑的定性試驗(yàn)；熒光分光光度法只能定量測(cè)定熒光物質(zhì)的總量；而色譜法是分析種類繁多、成分復(fù)雜的熒光增白劑的重要手段。與儀器設(shè)備昂貴、檢測(cè)成本高的液-質(zhì)聯(lián)用法相比，HPLC法的應(yīng)用更為廣泛。Shu等[9]使用TBA離子對(duì)試劑和液相色譜法分析了洗滌劑及表層水中的熒光增白劑；焦艷娜等[10]及吳鐘玲等[11]均建立了測(cè)定食品接觸材料中熒光增白劑的反相HPLC-FLD法。而關(guān)于化妝品中熒光增白劑的測(cè)試方法研究尚未見報(bào)道。

根據(jù)市場(chǎng)上熒光增白劑的使用情況，本文選擇了7種具有代表性的熒光增白劑:4,4′-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉鹽(FWA 85)、4,4′-雙(2-磺酸鈉苯乙烯基)聯(lián)苯(CBS 351)、4,4′-雙[(4-苯胺基-6-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉鹽(FWA 71)、4,4′-雙(苯并噁唑-2-基)二苯乙烯(FWA 393)、4,4′-雙(2-甲氧苯乙烯基)聯(lián)苯(FWA 378)、4,4′-雙(5-甲基-2-苯并噁唑基)二苯乙烯(FWA 368)、2,5-雙(5-叔丁基-2-苯并噁唑基)噻吩(FWA 184))作為研究對(duì)象，建立了美白面膜中上述7種熒光增白劑的靈敏、準(zhǔn)確的HPLC-FLD分析法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，配熒光檢測(cè)器(FLD)及色譜工作站；MinPlus型渦旋混合器(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)；DS-2510DTH型超聲波清洗機(jī)(上海生析超聲儀器有限公司)；TD5A-WS型臺(tái)式離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。其中，F(xiàn)WA 85和FWA 71熒光強(qiáng)度100%；CBS 351和FWA 393的純度≥97.0%；FWA 184的純度≥98.0%；FWA 368的純度≥95.0%；FWA 378的純度≥90.0%。甲醇、乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)、乙酸銨(德國(guó)CNW公司)為色譜純?cè)噭?；其他試劑均為分析純，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用超純水由Hi-tech KFLOW型超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)制備。

實(shí)驗(yàn)所用美白面膜購(gòu)自上海市某超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(精確至0.1 mg)，其中FWA 85、FWA 71和CBS 351分別用甲醇溶解并定容至100 mL，F(xiàn)WA 393、FWA 184、FWA 368和FWA 378分別用三氯甲烷溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的各熒光增白劑單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于4 ℃避光冷藏保存。

1.3 樣品前處理

稱取美白紙質(zhì)面膜精華液1.0 g(精確至0.1 mg)于50 mL具塞比色管中，加入15 mL乙腈，渦旋混合1 min后，于溫度30 ℃下超聲提取20 min，冷卻至室溫后用甲醇定容，搖勻。取部分溶液于50 mL聚丙烯離心管中，以5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，待HPLC-FLD測(cè)定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A：25 mmol/L乙酸銨溶液，B：甲醇；梯度洗脫程序：0.0 min，60%A+40%B；20.0 min，20%A+80%B；21.0 min，5%A+95%B；40.0 min，5%A+95%B。進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑及其用量選擇由于熒光增白劑具有較強(qiáng)極性，實(shí)驗(yàn)分別考察了N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇作為提取劑對(duì)樣品中7種熒光增白劑的超聲萃取效率。圖1的結(jié)果表明，乙腈對(duì)7種待測(cè)物有較高的提取率。進(jìn)一步比較了不同乙腈用量條件下7種熒光劑的回收率。由圖2可知，隨著乙腈用量的不斷增加，F(xiàn)WA 85的提取率逐漸降低，同時(shí)FWA 393、FWA 368呈現(xiàn)較大誤差，因此實(shí)驗(yàn)選擇使用15 mL的乙腈作為提取劑。

2.1.2超聲萃取條件選擇分別考察了不同超聲時(shí)間和萃取溫度條件下乙腈對(duì)7種熒光增白劑的提取效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，開始時(shí)熒光增白劑的萃取率隨超聲時(shí)間的增加上升，超聲時(shí)間為20 min時(shí)達(dá)到最高值；而后基本保持不變或下降。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明提取溫度對(duì)熒光增白劑的提取率影響不大，因此將超聲萃取條件確定為溫度30 ℃條件下提取20 min。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1熒光測(cè)試條件選擇分別對(duì)待測(cè)熒光物進(jìn)行多激發(fā)和多發(fā)射掃描試驗(yàn)，掃描范圍200～800 nm，步進(jìn)值為2 nm，結(jié)果見表1。由表1可見，7種熒光增白劑的最大激發(fā)波長(zhǎng)為360～367 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為420～436 nm，故選擇λex=365 nm、λem=430 nm。

表1 7種熒光增白劑的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)

2.2.2流動(dòng)相的選擇反相高效液相色譜常用甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)中為改善FWA 85和FWA 71的色譜峰拖尾情況，在流動(dòng)相中加入25 mmol/L乙酸銨。分別考察了甲醇-乙酸銨和乙腈-乙酸銨兩種流動(dòng)相條件下7種熒光增白劑的分離情況。乙腈-乙酸銨作流動(dòng)相時(shí)，F(xiàn)WA 85和CBS 351、FWA 393和FWA 378未獲得完全分離，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，故選擇甲醇-25 mmol/L乙酸銨體系作為流動(dòng)相。進(jìn)一步對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化，7種待測(cè)物在38 min內(nèi)獲得滿意分離。7種熒光增白劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖3。

2.2.3進(jìn)樣量的選擇通常，熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨其濃度的升高而下降，甚至發(fā)生猝滅。實(shí)驗(yàn)分別考察了進(jìn)樣量5 μL和10 μL條件下熒光增白劑的熒光強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，CBS 351、FWA378、FWA 184的熒光信號(hào)顯著下降。故選擇進(jìn)樣量為5 μL。

2.3 工作曲線、檢出限與定量限

在已確定的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同質(zhì)量濃度的7種熒光增白劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)WA 85和FWA 71以及其他5種熒光增白劑分別在5～35 mg/L和0.025～4 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.991。以信噪比(S/N)=3及S/N=10所對(duì)應(yīng)的被測(cè)化合物的含量作為方法的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)，7種熒光增白劑的儀器檢出限為0.00071～0.18 mg/L，定量限為0.12～12.24 μg/g。方法具有較高的靈敏度。

表2 7種熒光增白劑的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、方法的檢出限和定量限

2.4 準(zhǔn)確度及精密度

方法的準(zhǔn)確度用樣品的標(biāo)準(zhǔn)加入回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。取陰性美白面膜樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，加入回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，7種熒光增白劑的加標(biāo)平均回收率在93.62%～115.87%之間，RSD為0.43%～5.40%。表明方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

表3 7種熒光增白劑的方法回收率和精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市售的8種品牌美白面膜進(jìn)行了測(cè)定，上述7種熒光增白劑均未檢出。

3 結(jié)論

本文根據(jù)美白面膜樣品的特性，建立了以超聲萃取技術(shù)為主的前處理方法，7種目標(biāo)化合物獲得了較高的提取效率；并通過(guò)優(yōu)化色譜條件，建立了同時(shí)測(cè)定美白面膜中7種熒光增白劑的高效液相色譜-熒光分析法。該方法前處理簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足7種目標(biāo)化合物的定性定量分析，可為化妝品中熒光增白劑的分析測(cè)定提供科學(xué)參考。