張鵬程，李亞紅，鄭 嬌，陳繼云，陳丹丹，權(quán) 英，崔榮靜

(常熟理工學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

三聚氰胺(Melamine)簡稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，它是一種含氮量較高的重要有機(jī)化工原料[1]。三聚氰胺本身毒性較低，但是三聚氰胺在生物體腎臟細(xì)胞中會(huì)形成不溶于水的大分子復(fù)合物沉積下來，長期攝入會(huì)形成結(jié)石，最終導(dǎo)致腎衰竭[2,3]。目前食品和飼料粗蛋白含量通常采用“凱氏定氮法”來測(cè)定[4]，因?yàn)槿矍璋返暮扛哌_(dá)66.6%，而蛋白質(zhì)中的含氮量只有16%左右[5]，向產(chǎn)品中加入三聚氰胺可以使檢測(cè)出的蛋白質(zhì)含量虛高。目前檢測(cè)三聚氰胺的方法有很多種，傳統(tǒng)檢測(cè)方法有苦味酸法、升華法以及電位滴定法[6]，上述三種方法準(zhǔn)確度高，但這些方法都達(dá)不到國家對(duì)食品中三聚氰胺檢測(cè)的要求[7]。近些年來發(fā)展起來的新檢測(cè)方法有高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用法等[8]，上述的檢測(cè)方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)，但也存在諸多不足之處，不利于推廣使用。

辮狀螺旋碳納米纖維(Plait-like Carbon Nanocoils，CNCs)是一維納米碳結(jié)構(gòu)的一種特殊形態(tài)，它是由碳納米纖維構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。CNCs具有優(yōu)良的導(dǎo)電性能、較強(qiáng)的催化性能及磁性[9,10]。本文通過合成CNCs并探究其類酶活性，發(fā)現(xiàn)該納米材料具有類似辣根過氧化物酶的催化活性，可以催化TMB與H2O2反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。同時(shí)，三聚氰胺可以與H2O2反應(yīng)生成一種加成化合物[11]，從而消耗體系的H2O2?；谝陨涎芯?，建立了一種新的檢測(cè)三聚氰胺的方法，該方法靈敏度高、操作簡易。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；KKQ-50E型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；EL204型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；S-4800掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(日本，電子株式會(huì)社)。

三聚氰胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB,上海源葉生物科技有限公司)，聚二丙烯基二甲基氯化銨(PDDA,Sigma公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CNCs的合成根據(jù)文獻(xiàn)方法[12]，通過溶膠-凝膠方法制備NiO納米粒子。稱取20 mg的NiO納米粒子平均分散放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在通氫氣的環(huán)境下425 ℃反應(yīng)1 h，然后在乙炔氛圍中425 ℃反應(yīng)0.5 h，即可獲得產(chǎn)物CNCs。

1.2.2樣品使用前的處理稱取50 mg螺旋碳納米管與10 mL的PDDA(1∶100)及NaCl(0.5 mg/mL)的混合溶液混合，超聲5 min后，用水超聲洗滌5次，將產(chǎn)物配成5 mL溶液，取出2 mL烘干，得其濃度為2.70 mg/mL，剩下的溶液待用。

1.2.3檢測(cè)方法的建立依次向離心管中加入一定量的三聚氰胺溶液以及H2O2溶液，待反應(yīng)完全后再依次加入適量的0.2 mol/L乙酸鹽緩沖溶液(pH=4.0)、CNCs以及TMB溶液，總體積為3.0 mL，使CNCs、TMB濃度分別為25 μg/mL、200 μmol/L，三聚氰胺的濃度分別為0～70 μmol/L，將混合液放在70 ℃的水浴中反應(yīng)10 min后冰水浴5 min使反應(yīng)停止，然后置于TU-1901紫外分光光度計(jì)中掃描出400～800 nm的紫外圖譜。

1.2.4實(shí)際樣品前處理實(shí)際樣品按通用方法進(jìn)行預(yù)處理：稱取市售品牌奶粉1.0 g，加入6.5 mL 1% 三氯乙酸溶液和2.2 mL色譜純乙腈，蝸旋振蕩3.0 min，超聲5 min，1 3000 r/min離心10 min，取上清用0.45 μmol/L濾膜，以1%三氯乙酸稀釋至8 mL，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 辮狀螺旋碳納米纖維的表征

圖1A為辮狀螺旋碳納米纖維的掃描電子顯微鏡(SEM)的形貌圖，圖1B為CNCs的透射電子顯微鏡(TEM)圖。從圖中可以看出制備好的CNCs大部分都具有辮狀結(jié)構(gòu)，分別由兩個(gè)對(duì)稱的螺旋結(jié)構(gòu)的碳納米纖維組成，每根螺旋碳納米纖維的直徑大概在70～80 nm之間，其排列規(guī)則且分布均勻。

2.2 辮狀螺旋碳納米纖維類酶活性的研究

2.2.1pH值對(duì)CNCs催化活性的影響圖2(A)為吸光度與pH值的關(guān)系曲線，可見當(dāng)pH值為4.0時(shí)催化活性最強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)體系為中性或堿性時(shí)，催化劑基本不能催化H2O2氧化TMB并產(chǎn)生顏色反應(yīng)。原因在于，酸性條件下CNCs表現(xiàn)出的是過氧化物酶的催化活性，即CNCs首先催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基，同時(shí)生成CNCs-自由基復(fù)合物，后者與底物 TMB產(chǎn)生顏色反應(yīng)；在較中性或堿性條件下，CNCs呈現(xiàn)出的是過氧化氫酶的催化活性，即催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣和水[13]。

2.2.2溫度對(duì)CNCs催化活性的影響圖2(B)為吸光度與溫度的關(guān)系曲線，當(dāng)T=70 ℃時(shí)，CNCs催化活性最強(qiáng)，故以下實(shí)驗(yàn)溫度選定為70 ℃。另外，從圖中也可以看出CNCs的溫度適用范圍較廣，彌補(bǔ)了HRP酶在溫度高于40 ℃時(shí)失去催化活性的不足[14]。

2.2.3CNCs濃度對(duì)催化活性的影響圖3(A)為吸光度與CNCs濃度的關(guān)系曲線，當(dāng)反應(yīng)溶液中沒有CNCs時(shí)，吸光度只有0.1，隨著CNCs濃度的增大，吸光度增強(qiáng)，當(dāng)濃度增大25 μg/mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大，因此以下實(shí)驗(yàn)CNCs濃度為25 μg/mL。此外，從上圖中可以看出，CNCs具有生物酶微量高效的特點(diǎn)。

2.2.4以H2O2為底物時(shí)CNCs的表觀Km值圖3(B)為吸光度與H2O2濃度的關(guān)系曲線，從圖3(B)可知在一定范圍內(nèi)，體系的反應(yīng)速率隨H2O2濃度的增大而增大，最后趨于平緩，其變化規(guī)律符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)理論。由圖3(B) 可知，體系的反應(yīng)速率與H2O2濃度在一定范圍內(nèi)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。H2O2的使用濃度過高、過低都會(huì)影響檢測(cè)，為了能準(zhǔn)確的檢測(cè)出三聚氰胺，我們將H2O2的濃度確定為100 μmol/L。圖4(A)為吸光度與較低濃度的H2O2的關(guān)系曲線，圖4(B)為吸光度的倒數(shù)與H2O2濃度的倒數(shù)的關(guān)系曲線，根據(jù)米氏常數(shù)的求值公式:1/Acat=(1/Amax)+[Km/(Amax·C)]，CNCs對(duì)H2O2的米氏常數(shù)Km=0.126 mmol/L。該米氏常數(shù)較小，說明H2O2對(duì)CNCs親和力較強(qiáng)。

2.2.5以TMB為底物時(shí)CNCs的表觀Km值圖5(A)為吸光度與TMB濃度的關(guān)系曲線，從圖5(A)可知在一定范圍內(nèi)，體系的反應(yīng)速率隨TMB濃度的增大而增大，最后趨于平緩。圖5(B)為吸光度的倒數(shù)與TMB濃度的倒數(shù)的關(guān)系曲線，可得CNCs對(duì)TMB的米氏常數(shù)Km=0.547 mmol/L。

2.2.6米氏常數(shù)對(duì)比將CNCs對(duì)TMB、H2O2的米氏常數(shù)與辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)其的米氏常數(shù)作了對(duì)比，如表1中的總結(jié)，CNCs對(duì)于底物H2O2的Km值比HRP小，說明CNCs對(duì)底物H2O2的親和力高于HRP。但對(duì)于另一底物TMB而言，CNCs的Km值比HRP大，說明CNCs對(duì)底物TMB的親和力低于HRP。造成這一現(xiàn)象的原因可能與CNCs本身有關(guān)，也可能與我們采用了PDDA處理CNCs有關(guān)。采用PDDA處理可以使CNCs表面帶上正電荷，而CNCs表面的正電荷有助于吸附更多的羥基自由基[15]，從而提高對(duì)H2O2的親和力；而TMB是一種多氨基化合物，其在酸性緩沖體系中質(zhì)子化從而帶正電荷[16]，由于表面和底物TMB之間存在排斥力，所以降低了對(duì)TMB的親和力。CNCs對(duì)底物H2O2親和力的提高，說明只需要較低濃度的H2O2就可以達(dá)到較好的催化效果，有利于三聚氰胺的檢測(cè)。

表1 表觀Km值比較

2.3 三聚氰胺的檢測(cè)

圖6是吸光度與三聚氰胺濃度的關(guān)系曲線，三聚氰胺濃度為5～70 μmol/L。通過圖5可以得出，三聚氰胺的檢出限為1.8 μmol/L，其線性范圍為5～70 μmol/L，低于我國制定的三聚氰胺乳與乳制品臨時(shí)管理值(嬰幼兒配方乳粉三聚氰胺限量值為1 mg/kg，液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其配方乳粉以及含乳15%上其食品中三聚氰胺限量值為2.5 mg/kg)。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

在牛奶樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，測(cè)其回收率。按照1.2.4進(jìn)行樣品前處理。結(jié)果如表2所示，回收率在92%～104%之間。另外我們還測(cè)試了氨基酸分子對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氨基酸分子的存在不會(huì)干擾牛奶中三聚氰胺的測(cè)定。本方法操作簡便、分析時(shí)間短，不需要精密復(fù)雜的儀器，適用于食品中三聚氰胺的檢測(cè)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺

3 結(jié)論

本文合成了一種具有辮狀螺旋結(jié)構(gòu)的碳納米纖維(CNCs)，發(fā)現(xiàn)該碳納米纖維具有高效的類似辣根過氧化物酶(HRP)的催化活性，同時(shí)在較大的酸堿范圍以及溫度范圍內(nèi)都保持較高的催化活性，有著HRP不可比擬的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，根據(jù)三聚氰胺可以與H2O2反應(yīng)生成一種穩(wěn)定的加成化合物，建立了一種新的檢測(cè)三聚氰胺的方法，其檢出限達(dá)到了1.8 μmol/L。該方法簡單、快速、靈敏度高，有希望應(yīng)用于三聚氰胺的實(shí)際檢測(cè)，在食品安全檢測(cè)方面有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。