王坤趙灃凱李彥林賈迪余洋高寰宇肖渝李龍滕閆祥甲

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科（云南昆明650031）

2山東省棗莊市棗礦集團(tuán)公司中心醫(yī)院（山東棗莊277800）

T140靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路對(duì)豚鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的影響

王坤1趙灃凱2李彥林1賈迪1余洋1高寰宇1肖渝1李龍滕1閆祥甲1

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科（云南昆明650031）

2山東省棗莊市棗礦集團(tuán)公司中心醫(yī)院（山東棗莊277800）

目的：明確T140體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路對(duì)豚鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的影響，探討T140減緩軟骨退變的作用。方法：健康9月齡雄性Hartley豚鼠36只，隨機(jī)分成A、B、C三組，A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，C組為空白對(duì)照組，每組12只。于12周時(shí)，獲取膝關(guān)節(jié)軟骨，采用RT-PCR法檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)ColⅡ含量。結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示A組Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)量高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組ColⅡ含量高于B、C組（P＜0.05）。結(jié)論：T140于體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，減少關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，進(jìn)而減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

T140；SDF-1/CRCR4信號(hào)通路；Ⅱ型膠原蛋白；聚集蛋白聚糖

研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）是一種小分子趨化蛋白，在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵性作用［1］。趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）是SDF-1唯一的受體。在膝關(guān)節(jié)內(nèi)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）由滑膜組織分泌至關(guān)節(jié)腔中，CXCR4則表達(dá)于軟骨細(xì)胞表面，SDF-1與CXCR4結(jié)合可啟動(dòng)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，該信號(hào)通路是引起骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵［2］。在軟骨組織中，Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的減少或破壞被認(rèn)為是軟骨退變的重要形式。

我們的前期實(shí)驗(yàn)中，在體外培養(yǎng)軟骨的培養(yǎng)液里添加100 ng/ml的外源性SDF-1，并加入該信號(hào)通路的特異性拮抗劑T140進(jìn)行拮抗，結(jié)果表明T140可體外阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，阻止軟骨細(xì)胞釋放MMP-3、MMP-9及MMP-13，進(jìn)而減少軟骨中II型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解［3］。本研究以豚鼠原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎為模型，在前期體外實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討T140體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，觀測(cè)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)II型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的表達(dá)情況，進(jìn)一步探索T140延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。

1　材料與方法

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所完成。

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取健康的9月齡雄性Hartley豚鼠（四川達(dá)碩生物公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)；TBA287640-334）36只，體重1.2±0.1 kg，雄性，純化清潔級(jí)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的對(duì)待和照顧嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

T140凍干粉（美國(guó)Sigma公司），PBS粉（武漢博士德生物工程有限公司），RNeasy isolation kit（北京美科美佳生物科技開(kāi)發(fā)有限公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大），SDF-1（Sigma公司，美國(guó)），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（天根生化）。Alzet膠囊式微量滲透壓泵（上海普邁生物cellsciences公司），冰箱BCD-216AD（青島海爾股份有限公司），Real-Time PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及軟骨組織獲取

36只豚鼠隨機(jī)分成3組，即實(shí)驗(yàn)組（A組）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（B組）、空白對(duì)照組（C組），每組12只。A組中每只豚鼠皮下植入Alzet膠囊式微量滲透壓泵，其內(nèi)灌注無(wú)菌PBS液充分稀釋過(guò)的T140凍干粉，T140以濃度為180 μg/ml.d泵入豚鼠皮下組織，B組中每只豚鼠皮下植入Alzet膠囊式微量滲透壓泵，其內(nèi)僅僅灌注PBS液，C組中各只豚鼠不做任何處理。36只豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)至12周時(shí)，采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射法處死全部豚鼠，取下膝關(guān)節(jié)部軟骨。每組所取標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，一組用于PCR檢測(cè)，一組用于Western blot檢測(cè)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1RT-PCR檢測(cè)軟骨組織內(nèi)Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)

采用RNeasy isolation kit提取軟骨組織標(biāo)本中的總RNA。用紫外分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm條件下，測(cè)定所提取RNA吸光值，以O(shè)D260/ OD280的比值來(lái)鑒定mRNA純度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間時(shí)說(shuō)明所提取得RNA較純，雜質(zhì)少，取該比值區(qū)間的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后取其中的1 μg蛋白樣品按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以濃度為40 μg/μl的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及β-Actin作為內(nèi)參照。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，使用primers Express software軟件進(jìn)行分析設(shè)計(jì)各基因引物，豚鼠內(nèi)參基因β-ACTIN，上游引物：5'-CCACCATGTAC CCAGGCATT-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，DNA片段177 bp；豚鼠Ⅱ型膠原蛋白5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段103 bp；豚鼠聚集蛋白聚糖，上游引物：5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，下游引物：5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段199 bp。循環(huán)參數(shù)：95℃5 min預(yù)變性，95℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。使用Real-Time PCR儀檢測(cè)標(biāo)本中各基因的表達(dá)情況，為確保數(shù)據(jù)的有效性，每個(gè)樣品均平行做3個(gè)復(fù)孔。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)將各組Ct值轉(zhuǎn)換成2Ct后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析Ⅱ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)。

1.4.2Western Blot檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白的水平

軟骨組織中的總蛋白參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度計(jì)算上樣緩沖液中應(yīng)含總蛋白含量，使各組總蛋白水平相等。10 μg總蛋白在濃縮膠（6%）進(jìn)行SDS-PAGE電泳30min，繼續(xù)用15%分離膠將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行抗原抗體雜交反應(yīng)。先用脫脂牛奶封閉非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗滌后加入一抗，再洗滌加二抗，孵育1～2 h，在暗室內(nèi)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Western blotting kit）曝光顯影，圖像分析軟件（Quantity One）進(jìn)行目標(biāo)蛋白和β-actin的光密度測(cè)定，用目標(biāo)條帶與β-actin光密度比值反映蛋白相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行組間比較。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較時(shí)采用LSD檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖和β-ACTIN內(nèi)參基因引物擴(kuò)增的基因片段比照擴(kuò)增曲線及溶解曲線后，顯示了擴(kuò)增的單一性和一致性。膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本RT-PCR結(jié)果顯示，II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表達(dá)量A組最高，明顯高于B組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。B組與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表達(dá)量（n=12）

2.2Ⅱ型膠原蛋白的Western blot檢測(cè)

在軟骨組織的蛋白水平檢測(cè)中，可見(jiàn)II型膠原蛋白表達(dá)量A組比B、C組高，灰度最深，而B(niǎo)、C兩組灰度值差別不明顯（圖1）；A組與B、C兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。這表明，T140在體內(nèi)可增加軟骨組織II型膠原蛋白的表達(dá)量，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨的修復(fù)具有積極作用。

圖1　T140干預(yù)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）表達(dá)的影響

表2　各組II型膠原蛋白灰度值比較（n=12）

3　討論

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類(lèi)小分子趨化蛋白，能特異性結(jié)合趨化因子受體4（CXCR4）。在膝關(guān)節(jié)中，SDF-1由滑膜產(chǎn)生并分泌至關(guān)節(jié)腔及血液中，趨化因子受體4（CXCR4）屬于G蛋白偶聯(lián)受體，表達(dá)于軟骨細(xì)胞表面，是已知的SDF-1唯一的受體。SDF-1與CXCR4結(jié)合啟動(dòng)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，進(jìn)而引起基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)（MMPs）的釋放，通過(guò)破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)而發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。所以，SDF-1/CXCR4信號(hào)通路是引起骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵［2］。該通路還參與很多腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散［4，5］。故本研究中，以CXCR4為SDF-1拮抗劑（T140）治療的靶點(diǎn)，通過(guò)阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，探尋T140的靶向作用，為靶向治療OA尋找新的突破點(diǎn)。

由于Hartley豚鼠的原發(fā)性O(shè)A模型的病理特征與人原發(fā)性O(shè)A相似［6］，該原發(fā)性O(shè)A動(dòng)物模型的組織學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)類(lèi)似人OA的變化特征［7，8］。OA病變于9月至12月最明顯，OA的嚴(yán)重程度與蛋白多糖及膠原含量的減少相平行。錢(qián)麗萍等［9］的觀點(diǎn)也認(rèn)為，豚鼠OA的動(dòng)物模型與人OA相似性最高。故本實(shí)驗(yàn)選用9月齡Hartley豚鼠作為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的研究模型。

膠原和聚集蛋白聚糖對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨的彈性及硬度具有重要作用，在關(guān)節(jié)軟骨退變中是主要的保護(hù)性因素。II型膠原構(gòu)成纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)中的主體，聚集蛋白聚糖使軟骨具有抵抗壓力和分散負(fù)荷的能力。聚集蛋白聚糖的丟失往往被認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎的早期主要表現(xiàn)，聚集蛋白聚糖核心蛋白特定位點(diǎn)斷裂產(chǎn)生的片斷可在OA患者的軟骨及關(guān)節(jié)液中被發(fā)現(xiàn)。關(guān)節(jié)軟骨表面的纖維樣改變與軟骨基質(zhì)中小分子聚集蛋白聚糖的丟失有密切關(guān)系。II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)中的主要成分，所以二者的表達(dá)和凋亡情況是反映軟骨退變程度的最好指標(biāo)。因此，本研究中，我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組軟骨II型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)情況，Western blotting檢測(cè)軟骨內(nèi)II型膠原蛋白的含量，以便觀測(cè)T140靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路后，軟骨組織中保護(hù)性元素的變化情況。

T140是一種含14個(gè)氨基酸的能特異性結(jié)合并阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的小分子多肽，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的CXCR4受體拮抗劑，T140［10］是CXCR4受體的安全拮抗劑，能有效阻止SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，目前主要用于抗艾滋病、抗腫瘤以及抗慢性炎癥疾病的靶向藥物研究，但在靶向治療OA軟骨退變方面報(bào)道甚少［11］。

在我們前期關(guān)于T140干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的體外實(shí)驗(yàn)研究中［3］，通過(guò)體外培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織塊，加入T140進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)T140可體外阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，緩解軟骨細(xì)胞降解II型膠原蛋白。此次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，A組（含T140）豚鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)II型膠原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA表達(dá)量最高，明顯高于B組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot結(jié)果顯示，A組（含T140）II型膠原蛋白表達(dá)量也高于B、C兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析認(rèn)為，T140通過(guò)與SDF-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CXCR4位點(diǎn)，靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，減少I(mǎi)I型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，進(jìn)而可以延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

綜上，雖然目前在改變OA病程進(jìn)展方面藥物治療基本無(wú)效［12］，但是通過(guò)靶點(diǎn)干預(yù)防治骨關(guān)節(jié)炎具有可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，T140在體內(nèi)可以靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，減少I(mǎi)I型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的降解，在防止關(guān)節(jié)軟骨退變方面有積極作用，有望成為治療OA的有效藥物。但是，本研究尚存在不足，如：Sox9基因作為轉(zhuǎn)錄激活因子，在軟骨細(xì)胞增殖、分化及軟骨形成中發(fā)揮了重要作用，加入T140干預(yù)后，如果進(jìn)一步檢測(cè)Sox9基因的表達(dá)變化，并且深入探討Sox9基因與ColⅡ及SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的關(guān)系等，可能獲得更進(jìn)一步的支持。

［1］Wei LKK，Lee M，Wei X，et al.Stimulation of chondrocyte hypertrophy by chemokine stromal cell-derived factor 1 in the chondro-osseous junction during endochondral bone formation［J］.Dev Biol，2010，341：236-245.

［2］Zhang H，Zhang L，Chen LW，et al.Stromal Cell-derived Factor-1anditsReceptorCXCR4areUpregulated Expression in Degenerated Intervertebral Discs［J］.Int J Med Sci，2014，11（3）：240-245.

［3］馬珂，李曉林，李彥林，等.T140體外阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路組織人關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白降解的研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（12）：1879-1882.

［4］ChengZ，ZhouS，WangK，eta1．Characterizationand application of two novel mouoclonal antibodies against human CXCR4：cell prolife ration and migration regulation for glioma cell line in vitro by CXCR4/SDF-1 alpha signal［J］．Hybridoma（Larchmt），2009，28（1）：33-41．

［5］Ander F，Xia W，Conforti R，et a1.CXCR4 expression in early breast cancer and risk of diatant recurrence［J］．Oncologist，2009，14（12）：1182-1188．

［6］Wei F，Moore DC，Wei L，et al.Correction：Attenuation of osteoarthritis via blockade of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway［J］.Arthritis Res Ther，2013，15（4）：410.

［7］Tonge DP，Bardsley RG，Parr T，et al.Evidence of changes to skeletal muscle contractile properties during the initiation of disease in the ageing guinea pig model of osteoarthritis［J］. Longev Healthspan，2013，2（1）：15.

［8］Wang T，Wen CY，Yan CH，et al.Spatial and temporal changes of subchondral bone proceed to microscopic articular cartilage degeneration in guinea pigs with spontaneous osteoarthritis［J］. Osteoarthritis Cartilage，2013，21（4）：574-581.

［9］錢(qián)麗萍，周乙華，瞿葉清，等.骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，31（11）：1026-1029.

［10］BoulaisPE，DuludeD，CabanaJ，etal.Photolabeling identifies transmembrane domain 4 of CXCR4 as a T140 binding site［J］.Biochem Pharmacol，2009，78（11）：1382-1390.

［11］HummelS，VanAkenH，ZarbockA.InhibitorsofCXC chemokine receptor type 4：putative therapeutic approaches in inflammatory diseases［J］.Curr Opin Hematol，2014，21（1）：29-36.

［12］Wei FY，Douglas C Moore1，Li YL，et al.Attenuation of osteoarthritis via blockade of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway［J］.Arthritis Research&Therapy，2012，14：R177.

The Effect of T140 on TypeⅡCollagen and Aggrecan in Articular Cartilage of Guinea Pigs

Wang Kun1，Zhao Fengkai2，Li Yanlin1，Jia Di1，Yu Yang1，Gao Huanyu1，Xiao Yu1，Li Longteng1，Yan Xiangjia1
1 Department of Sports Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan，China 650031
2 Department of Osteoarthritis，Central Hospital of Shandong Zaozhuang Mining Group，Shandong，China 277800

Li Yanlin，Email：852387873@qq.com

Objective The purpose of this study is to explore the effect of T140（an antagonist of SDF-1/ CRCR4 signaling pathway）on typeⅡcollagen and aggrecan in articular cartilage of guinea pigs.Methods 36 9-month-old male healthy Hartley guinea pigs were divided into three groups：experimental group（A，n=12），experimental control group（B，n=12）and blank control group（C，n=12）.Pigs in group A were implanted Alzet capsule type micro osmotic pressure pump containing T140 diluted by PBS solution and in group B implanted the pump containing PBS solution only.Articular cartilages of knee joint were harvested for measuring mRNA levels of typeⅡcollagen and aggrecan with RT-PCR and protein levels of typeⅡcollagen with Western blot 12 weeks later.Results The mRNA levels of the typeⅡcollagen and aggrecan in group A were significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.The content of typeⅡcollagen in group A was also significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.Conclusion T140 reduces the degradation of typeⅡcollagen and aggrecan through blocking the SDF-1/CRCR4 signaling pathway and so as decreases the risk of cartilage degeneration.

T140，SDF-1/CRCR4 signaling pathway，typeⅡcollagen，aggrecan

2015.07.05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81460340）；云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2014HC018）；云南省醫(yī)學(xué)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目（編號(hào)：D-201207）

李彥林，Email：852387873@qq.com