王一帆 李臻 潘教文 王慶國(guó) 劉煒

摘要：本研究以“豫谷1號(hào)”cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得類受體蛋白激酶基因SiRLK35（NCBI登錄號(hào)：XM_004956247.2 ）的全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析顯示，該基因編碼蛋白由392個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含一個(gè)S_TKc保守結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)TFS2N結(jié)構(gòu)域，含3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端有信號(hào)肽。 SiRLK35基因經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后，利用pET-28a構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21（DE3），經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于25℃誘導(dǎo)12 h后，在44.6 kD處得到一明顯誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶，表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期相符，證明SiRLK35基因可在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究SiRLK35基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷子；類受體蛋白激酶；SiRLK35；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S515+Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）09-0001-05

Cloning of Receptor-Like Protein Kinase Gene SiRLK35

from Foxtail Millet and Its Prokaryotic Expression

Wang Yifan1， 2，Li Zhen1，Pan Jiaowen1，Wang Qingguo1，Liu Wei1*

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of

Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China；

2. College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

AbstractIn this research， the full-length sequence of receptor-like protein kinase gene SiRLK35 （NCBI accession number： XM_004956247.2） was amplified by PCR technique with the cDNA of Yugu 1 as template. Bioinformatics analysis showed that the protein product of SiRLK35 was composed of 392 amino acids. It contained one S_TKc conserved domain， one TFS2N domain， three transmembrane domains and a N terminal signal peptide. The sequence of SiRLK35 was digested with BamHⅠ and SalⅠ， and then the recombined prokaryotic expression vector pET-28a-SiRLK35 was constructed successfully through connecting the fragment with pET-28a. The recombinant was further transformed into E.coli strain BL21 （DE3）. Induced with 0.5 mmol/L IPTG， a 44.6 kD fusion protein was obtained， which proved that the SiRLK35 could be induced to express in E.coli. This research layed a good foundation for further study of the function of SiRLK35 gene.

KeywordsFoxtail millet； Receptor-like protein kinase； SiRLK35； Prokaryotic expression

谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]又稱為粟，是起源于我國(guó)的古老作物，具有抗旱耐貧瘠的特點(diǎn)，是旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要組成部分。近年來(lái)，其營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值、國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力和產(chǎn)量潛力受到研究者的普遍關(guān)注[1]。對(duì)谷子進(jìn)行有目的、有針對(duì)性的品質(zhì)、性狀研究及抗逆機(jī)制的解析是現(xiàn)代谷子基因組學(xué)研究發(fā)展的重要方向。

前期研究中，通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)，以自然干旱處理的“豫谷1號(hào)”幼苗為材料，篩選到一個(gè)響應(yīng)干旱、蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)的類受體蛋白激酶（編號(hào)K3ZRC5），對(duì)其編碼基因序列分析顯示，其屬于S-類受體蛋白激酶亞家族，命名為SiRLK35，推測(cè)其可能參與谷子干旱響應(yīng)過(guò)程，并在谷子抗旱過(guò)程中發(fā)揮作用。

類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinases， RLKs）在植物中廣泛存在，數(shù)量眾多，具有較廣泛的生物學(xué)功能[2]。動(dòng)物、植物中的RLKs具有較高的同源性，結(jié)構(gòu)上主要包括胞外受體結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)激酶域三部分[3]，作為信號(hào)分子受體，它們能夠感知胞外信號(hào)并將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)。植物RLKs廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、自交不親和、生物與非生物脅迫及激素響應(yīng)等諸多過(guò)程[4，5]。

根據(jù)胞外氨基端序列的不同，植物RLKs主要分為包含S-類受體蛋白激酶在內(nèi)的10個(gè)亞家族，Walker等[6]在1990年首次從玉米中鑒定到S-類受體蛋白激酶Zmpk1，之后在其它物種中該類RLKs也相繼被發(fā)現(xiàn)。

本研究擬圍繞SiRLK35基因進(jìn)行較為系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-SiRLK35，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)基因的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白產(chǎn)物做進(jìn)一步研究，為將該基因應(yīng)用于谷子抗旱研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

研究所用材料為“豫谷1號(hào)”。

TransTaq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）試劑盒、T4 DNA Ligaes試劑盒、2×EasyTaq SuperMix及Trans2K Plus DNA Marker均購(gòu)于Transgen公司（山東濟(jì)南雨同生物科技有限公司），PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、pMD18-T Vector試劑盒、pET-28a載體及DL5000 DNA Marker均購(gòu)于TaKaRa公司，純質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)于BioTeke公司（濟(jì)南承森貿(mào)易有限公司），薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于GENERAY Biotechnology，引物由上海英濰捷基公司合成，其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2谷子幼苗RNA的提取及單鏈cDNA的獲得

取培養(yǎng)3周的“豫谷1號(hào)”幼苗，按TransZol Plant試劑盒說(shuō)明書提供的方法提取谷子RNA，并參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書將所得到谷子RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。

1.3SiRLK35基因的克隆

根據(jù)SiRLK35基因序列，使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物SiRLK35S12：5′-CGGGATCCATGGAAGCCTTCATGGGCATC-3′，SiRLK35A12：5′-CGGTCGACTAAATTTGACTTCATTTCAGCCAGCTG-3′（下劃線分別為BamHⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)），以谷子幼苗cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq SuperMix 10 μL、引物SiRLK35S12及引物SiRLK35A12各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.4SiRLK35基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy （http：//www.expasy.org/#）網(wǎng)站預(yù)測(cè)SiRLK35基因編碼蛋白分子量、等電點(diǎn)，使用SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)SiRLK35蛋白結(jié)構(gòu)域，使用SignalP4.1 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽分析，使用TMPred （http：//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html）網(wǎng)站分析其跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.5SiRLK35原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的SiRLK35基因回收純化，與pMD18-T載體用T4 DNA連接酶于22℃連接5 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂于100 mg/L Amp抗性LB平板，于37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)構(gòu)建的中間表達(dá)載體，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后，送至山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序室測(cè)序。

使用BamHⅠ、SalⅠ分別酶切測(cè)序正確的pMD18-T-SiRLK35質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pET-28a，回收純化酶切片段，用T4 DNA連接酶22℃連接5 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切檢測(cè)。選擇鑒定正確的pET-28a-SiRLK35質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌落菌液PCR鑒定，獲得陽(yáng)性菌株。

用pET-28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂于100 mg/L Kan抗性LB平板，于37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定，獲得陰性對(duì)照。

1.6SiRLK35融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定

分別將含有重組質(zhì)粒pET-28a-SiRLK35的BL21（DE3）菌株及陰性對(duì)照菌株于37℃振蕩培養(yǎng)，菌液按1∶50比例用液體LB培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）于25℃、200 r/min誘導(dǎo)12 h。收集菌液經(jīng)超聲波破碎后，5 000 r/min離心10 min，分別取破碎菌液、上清、沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色、脫色后觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1SiRLK35基因的克隆

2.2SiRLK35基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPASy網(wǎng)站預(yù)測(cè)SiRLK35基因編碼蛋白包含392個(gè)氨基酸殘基，分子量為44.6 kD，等電點(diǎn)為6.88。使用SMART網(wǎng)站分析SiRLK35蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，在1～200氨基酸之間含有一個(gè)S_TKc保守結(jié)構(gòu)域，為Ser/Thr蛋白激酶區(qū)，在311～386氨基酸之間有一個(gè)TFS2N結(jié)構(gòu)域（圖2）。通過(guò)SignalP4.1網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果顯示，代表C值的線段在第30個(gè)氨基酸處分值較高，顯示該處為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，1～28個(gè)氨基酸殘基屬信號(hào)肽，第29和第30個(gè)氨基酸殘基之間為信號(hào)肽裂解點(diǎn)（圖3）。使用TMPred網(wǎng)站分析顯示SiRLK35蛋白有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

使用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pMD18-T-SiRLK35質(zhì)粒，回收純化SiRLK35片段，定向連入原核表達(dá)載體pET-28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α菌株，酶切驗(yàn)證，得到預(yù)期大小片段（圖5）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，進(jìn)一步進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選到陽(yáng)性克隆，獲得SiRLK35的原核表達(dá)載體pET-28a-SiRLK35 。

M：Trans2K Plus DNA Marker；1：酶切片段。

圖5pET-28a-SiRLK35酶切驗(yàn)證

M：DL5000 DNA Marker；H2O：空白對(duì)照；-：陰性對(duì)照，空載體

pET-28a；+：陽(yáng)性對(duì)照，質(zhì)粒pET-28a-SiRLK35；1～7：陽(yáng)性克隆。

圖M：Blue Plus Ⅱ Protein Marker；1、2、3分別為含pET-28a-SiRLK35菌株誘導(dǎo)12 h后的上清、破碎菌液和沉淀；4、5、6分別為含pET-28a菌株誘導(dǎo)12 h后的上清、菌體上清混合物和沉淀。

圖8SiRLK35融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

3討論與結(jié)論

谷子是起源于我國(guó)的傳統(tǒng)作物，在我國(guó)北方地區(qū)種植廣泛。谷子根系發(fā)達(dá)，蒸騰系數(shù)低，具有突出的抗旱性能[7]。近期，谷子基因組測(cè)序工作的完成為從分子水平揭示谷子抗旱機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[8]。

本課題組通過(guò)iTRAQ技術(shù)，以干旱處理的“豫谷1號(hào)”幼苗為材料，篩選到一個(gè)S-類受體蛋白激酶基因，命名為SiRLK35，檢索其序列并設(shè)計(jì)特異性引物，以谷子cDNA為模板，利用PCR技術(shù)成功克隆到基因全長(zhǎng)。生物信息學(xué)分析顯示，SiRLK35基因編碼蛋白由392個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，等電點(diǎn)為6.88；結(jié)構(gòu)分析顯示，SiRLK35蛋白包含一個(gè)S_TKc保守結(jié)構(gòu)域，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)，帶有磷酸化位點(diǎn)，是信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中心[9]，此外還含有一個(gè)TFS2N結(jié)構(gòu)域；信號(hào)肽分析顯示，該蛋白N端有信號(hào)肽，推測(cè)屬于分泌型蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示，該蛋白含3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，符合類受體蛋白激酶結(jié)構(gòu)特征。

外源基因表達(dá)系統(tǒng)在生物學(xué)研究中應(yīng)用普遍，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是蛋白表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早的一項(xiàng)[10]。盡管大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法進(jìn)行翻譯后加工（肽鏈折疊、氨基酸的修飾等），表達(dá)的蛋白多以無(wú)生物活性的包涵體形式存在，但其憑借培養(yǎng)方便、價(jià)格低廉、可大規(guī)模生產(chǎn)、遺傳背景清楚、能夠高水平表達(dá)外源基因、寄主菌株及載體較多以及安全性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[11]，依然是目前應(yīng)用最普遍、最成熟的外源基因表達(dá)系統(tǒng)[12]。pET系統(tǒng)能阻止影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速度的毒性基因的克隆且能優(yōu)化靶蛋白表達(dá)，廣泛應(yīng)用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[13]，BL21（DE3）是pET系統(tǒng)最常用的表達(dá)宿主菌。IPTG是在誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中最常使用的誘導(dǎo)劑，穩(wěn)定且不被細(xì)菌代謝。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用在多個(gè)物種的基因外源表達(dá)中，楊書玲等[14]克隆了小麥TaPDK基因，通過(guò)大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了表達(dá)并將蛋白純化；宋楊等[15]克隆了短枝型蘋果MdRGL基因，并通過(guò)pEGX-4T表達(dá)載體在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了該基因的表達(dá)；趙麗等[16]在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了水稻類受體蛋白激酶OsESG1的原核表達(dá)。

本研究利用pET系統(tǒng)構(gòu)建了SiRLK35基因的原核表達(dá)載體pET-28a-SiRLK35，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于25℃、200 r/min誘導(dǎo)12 h，實(shí)現(xiàn)了SiRLK35基因在大腸桿菌中的表達(dá)，且誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在沉淀中含量較多，推測(cè)其主要以包涵體的形式存在，為進(jìn)一步研究該基因功能以及抗體制備奠定了基礎(chǔ)。下一步將在該工作的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)分離、純化目的蛋白，進(jìn)而制備蛋白特異性抗體，檢測(cè)SiRLK35蛋白在植物中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步解析SiRLK35基因功能奠定基礎(chǔ)。

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