葉興國　杜麗璞

從轉(zhuǎn)基因技術(shù)角度談轉(zhuǎn)基因植物的安全性

葉興國杜麗璞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081）

目前，將外源基因轉(zhuǎn)入植物的方法主要包括基因槍介導(dǎo)法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基礎(chǔ)的基因組編輯技術(shù)尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)正在植物改良中迅速發(fā)展。

1　基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)與轉(zhuǎn)基因植物的安全性

基因槍法屬于一種物理操作，以高壓氦氣作為驅(qū)動力，即將擬轉(zhuǎn)化的基因包裹到直徑為1.0μm左右的金粉顆粒表面，均勻涂抹在載體膜片上，按動擊發(fā)按鈕后高壓氣體沖破壓力控制膜片，載體膜高速向下運動，被稍下位置的金屬阻擋網(wǎng)阻擋，上面攜帶的金屬微粒脫離后繼續(xù)高速向下運動，擊中樣品室中的植物組織靶材料，目標(biāo)基因隨金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)入植物細(xì)胞核，并整合到植物染色體上（圖1），通過篩選和組織培養(yǎng)再生環(huán)節(jié)獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因隨植物細(xì)胞的分裂而復(fù)制，隨植物的開花結(jié)實而穩(wěn)定遺傳。利用基因槍轉(zhuǎn)化植物所改良的性狀由轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因決定，基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)并不能引起植物基因組的改變和性狀的變異?；驑屴D(zhuǎn)化法已經(jīng)在很多作物上取得了成功，如小麥、玉米、大麥、大豆等，并將一些與抗病性、抗逆性、品質(zhì)、生長發(fā)育等性狀改良相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入了上述植物，但迄今為止只有美國孟山都公司利用基因槍轉(zhuǎn)化獲得的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)，利用基因槍轉(zhuǎn)化改良的其他植物品種還沒有獲準(zhǔn)在生產(chǎn)上種植。基因槍轉(zhuǎn)化法雖然有轉(zhuǎn)化受體品種范圍寬、可以進(jìn)行細(xì)胞器轉(zhuǎn)化等優(yōu)點，但同時具有操作比較復(fù)雜、成本比較高、轉(zhuǎn)化片段不明確、轉(zhuǎn)入基因容易沉默等缺點，所以，該方法目前主要用于基因功能鑒定、亞細(xì)胞定位等基礎(chǔ)研究。

圖1　基因槍轉(zhuǎn)化植物技術(shù)示意圖

2　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)與轉(zhuǎn)基因植物的安全性

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化屬于一種生物操作，所有農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)除了染色體之外，都含有數(shù)量不等的環(huán)狀Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒，上面攜帶一段可以自然轉(zhuǎn)入植物的DNA片段（transfer DNA，T-DNA）。在農(nóng)桿菌侵染植物組織，使植物產(chǎn)生冠癭瘤的過程中，T-DNA即進(jìn)入植物細(xì)胞，在一些植物蛋白質(zhì)的保護(hù)和協(xié)助下進(jìn)入植物細(xì)胞核，并進(jìn)一步整合到植物染色體上（圖2），通過在含有抗生素的培養(yǎng)基上篩選和組織培養(yǎng)再生環(huán)節(jié)獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)入基因同樣隨植物細(xì)胞的分裂而復(fù)制，隨植物的有性繁殖或無性繁殖而穩(wěn)定遺傳。作為革蘭氏陰性細(xì)菌的成員之一，農(nóng)桿菌廣泛存在于土壤中，可以天然轉(zhuǎn)化雙子葉植物，是天然的“遺傳工程師”。2015年比利時、中國、美國和國際馬鈴薯研究中心的科學(xué)家們合作在頂級刊物PNAS上發(fā)表文章，他們對291個非轉(zhuǎn)基因的栽培甘薯品種進(jìn)行了DNA分子檢測和基因表達(dá)分析，在所有的檢測樣品都發(fā)現(xiàn)了農(nóng)桿菌序列的存在，并發(fā)現(xiàn)其中4個基因與農(nóng)桿菌中的Acs、C-prot、iaaH和iaaM基因同源，這4個基因在甘薯的莖、葉和塊根中都有表達(dá)。認(rèn)為在甘薯的進(jìn)化過程中，農(nóng)桿菌和甘薯祖先之間發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移，自然選擇又保留了這些性狀。表明甘薯是一種天然的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因在甘薯生長發(fā)育過程中已經(jīng)自然發(fā)生。而人類種植甘薯的歷史可以追逐到8000～10000年前，即人類在不知不覺中食用了幾千年的天然轉(zhuǎn)基因甘薯。

圖2　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物技術(shù)示意圖

農(nóng)桿菌既然可以天然侵染和轉(zhuǎn)化甘薯，同樣可以天然侵染和轉(zhuǎn)化其他雙子葉植物，亦即人類食用的其他雙子葉植物或許也含有農(nóng)桿菌天然轉(zhuǎn)入的基因。20世紀(jì)90年代以前，人們僅認(rèn)識到雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然宿主。此后，經(jīng)過科學(xué)家們對農(nóng)桿菌侵染條件的優(yōu)化，農(nóng)桿菌可以侵染并轉(zhuǎn)化水稻、玉米、小麥、大麥等單子葉植物。由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)具有操作簡單、成本低廉、轉(zhuǎn)基因沉默幾率小、插入基因拷貝數(shù)低等優(yōu)點，已經(jīng)成為培育轉(zhuǎn)基因植物品種的首選技術(shù)。截至近幾年，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的植物已達(dá)到100多種。事實上，目前全球大面積推廣的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜和木瓜大多都是借助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的產(chǎn)品。需要再次強調(diào)的是，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入植物中的僅僅是人為構(gòu)建到其環(huán)狀質(zhì)粒T-DNA區(qū)的目標(biāo)基因，農(nóng)桿菌染色體上和環(huán)狀質(zhì)粒上T-DNA區(qū)之外的基因并不進(jìn)入植物。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)不會導(dǎo)致植物中非目標(biāo)基因控制性狀的遺傳變異，所以，天然的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)不具有風(fēng)險性。只要經(jīng)過嚴(yán)格安全性評價的目標(biāo)基因?qū)χ参铩⑷祟?、環(huán)境、動物和微生物無害，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品勢必具有安全性。

3　 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其產(chǎn)品的安全性

CRISPR/Cas9技術(shù)是根據(jù)擬編輯、修飾或激活的目標(biāo)基因序列，設(shè)計一段20bp左右的引導(dǎo)RNA序列（gRNA），將該gRNA序列與核酸酶Cas9編碼序列（具有酶切功能，類似一把剪刀）構(gòu)建到表達(dá)載體上，利用農(nóng)桿菌或基因槍方法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，gRNA引導(dǎo)Cas9對與gRNA具有同源性的目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，達(dá)到優(yōu)化、沉默或激活目標(biāo)基因的目的?；蚓庉嫾夹g(shù)可以不涉及到外源DNA序列的整合，盡管在獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植株中外源gRNA序列、Cas9序列和篩選標(biāo)記序列有可能插入到植物基因組上，但由于gRNA序列、Cas9序列和篩選標(biāo)記序列與目標(biāo)基因不存在連鎖關(guān)系，在T0代轉(zhuǎn)基因植株自交后產(chǎn)生的T1代轉(zhuǎn)基因植株中，能夠非常容易地篩選到目標(biāo)基因編輯而不含有表達(dá)載體上任何序列（包括gRNA、Cas9和篩選標(biāo)記）的期望植株。因此，基因組編輯只對植物中原本存在的目標(biāo)基因進(jìn)行了修飾，沉默植物中的不良基因，激活植物中的優(yōu)良基因或增強優(yōu)良基因的表達(dá)水平，但基因編輯植株中不含體外轉(zhuǎn)入的DNA序列，基因組編輯植株并非真正意義上的轉(zhuǎn)基因植株，在本質(zhì)上等同于傳統(tǒng)育種方法獲得的遺傳變異，進(jìn)一步培育的植物品種安全可靠。因而，一些國家已出臺政策，將不對利用基因組編輯技術(shù)獲得的植物產(chǎn)品進(jìn)行任何形式的安全性評價。最近，美國農(nóng)業(yè)部宣布免除對CRISPR/ Cas9基因組編輯工具進(jìn)行遺傳修飾的蘑菇進(jìn)行監(jiān)管，批準(zhǔn)種植和銷售，成為第一例得到美國政府上市許可的CRISPR/Cas9基因組編輯生物品種。

2016-06-29）