喻靜蘭,孫建春,楊 曄

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

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三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控

喻靜蘭,孫建春,楊 曄

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

[目的]研究三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控途徑，為通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件來提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提供依據(jù)和參考。[方法]采用紫外分光光度計測定β-胡蘿卜素的含量，優(yōu)化正負菌孢子接入種子培養(yǎng)基的接種比例，通過對三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控分析，確定最佳補液時間，優(yōu)化培養(yǎng)溫度和接種比例來提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。[結(jié)果]最佳孢子接種比例為正菌∶負菌=10∶1,最佳補液時間為52 h,最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃,最佳種子液接種比例為8%。[結(jié)論]通過對菌體生長代謝的分析優(yōu)化了培養(yǎng)條件，并將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量從1.45 g/L提高到2.26 g/L，產(chǎn)量提高了55.9%，取得了較好的效果，為β-胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

三孢布拉霉; β-胡蘿卜素; 發(fā)酵; 代謝調(diào)控

β-胡蘿卜素是重要的維生素A前體[1]，具有較強的抗氧化作用，在食品、保健品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要用途。目前，我國β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法3種[2-3]。其中，微生物發(fā)酵法由于產(chǎn)品天然且不受環(huán)境條件限制、培養(yǎng)周期短、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點，越來越受到重視，已成為天然β-胡蘿卜素的主要生產(chǎn)方法。三孢布拉霉菌具有生長迅速、生物量大和類胡蘿卜素合成產(chǎn)量高等特點，是發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的優(yōu)良菌種。研究表明，通過將該菌的正、負單性菌株混合發(fā)酵可獲得較高產(chǎn)量的β-胡蘿卜素[4]。筆者對菌株發(fā)酵種子液培養(yǎng)期的初級代謝結(jié)果進行分析，并根據(jù)分析結(jié)果對初級代謝階段的發(fā)酵條件進行一系列的優(yōu)化，從而提高最終產(chǎn)物β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1　材料與方法

1.1菌種三孢布拉霉(Blakesleatrispora)：正菌H5-30，負菌H6-1，由上?；ぱ芯吭荷锘嶒炇冶４?。

1.2儀器和試劑分光光度計UV755B；無水乙醇，石油醚。

1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：土豆汁200 g/L，葡萄糖200 g/L，蛋白胨100 g/L，瓊脂200 g/L，VB15 mg/L；種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉80 g/L，玉米粉28 g/L，VB150 g/L，淀粉酶1滴；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉80 g/L，黃豆餅粉16 g/L，酵母膏2 g/L，異煙肼0.4 g/L，VB15 mg/L，KH2PO40.6 g/L，MnSO40.3 g/L，Triton 1.2 g/L，煤油24 g/L，豆油66 g/L。

1.4培養(yǎng)方法

1.4.1孢子懸浮液的制備。將甘油管保藏的正負菌菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至孢子長出，用25 mL無菌水洗滌孢子并用2層紗布過濾，分別得到正負菌孢子懸浮液。取1 mL孢子懸浮液稀釋至6 mL，用分光光度計在波長650 nm下測定吸光度，計算懸浮液的孢子濃度。

1.4.2種子培養(yǎng)。按照正菌孢子懸浮液接種量為3，負菌孢子接種量為0.3的接種比例接入種子培養(yǎng)基，在27 ℃、230 r/min下培養(yǎng)24 h。

1.4.3發(fā)酵培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在27 ℃、230 r/min下培養(yǎng)120 h。1.5β-胡蘿卜素的提取和測定將培養(yǎng)好的菌絲分別用200目絲網(wǎng)抽濾，溫水沖洗至濾液無色，稱取濕重；在80～90 ℃下烘干至恒重，計算生物量。稱取適量菌體至10 mL離心管，加鋼珠和5 mL二甲基亞砜∶三氯甲烷=2∶3的混合液，振蕩打磨45 min后離心，浸出液用無水乙醇稀釋100倍后，在波長455 nm下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算β-胡蘿卜素的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1β-胡蘿卜素含量標準曲線精確稱取β-胡蘿卜素標準品晶體，用石油醚溶解并稀釋成濃度梯度，在其最長吸收波長455 nm下[5]測定其吸光度，以β-胡蘿卜素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，最大吸收波長為455 nm，其回歸方程為y=1.143 8x+0.007 3，R2=0.999 8?？梢娫谠摬ㄩL下β-胡蘿卜素的濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1　β-胡蘿卜素標準曲線Fig.1　The standard curve of β-carotene

2.2正負菌孢子懸浮液接種量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響將培養(yǎng)好的正負菌孢子以孢子懸浮液的形式按一定比例混合接入種子液培養(yǎng)基的方法[6-7]進行種子液培養(yǎng)，并對正負菌孢子的接種量進行梯度條件試驗。

將正負菌孢子懸浮液按照表1的梯度交叉配對接入種子培養(yǎng)基，經(jīng)過全流程發(fā)酵培養(yǎng)，得到β-胡蘿卜素產(chǎn)量，并進行等高線曲面繪圖分析。

表1　正負菌接種量

由圖2可知，最佳接種比例：正菌0.65～0.77，負菌0.055～0.085，正負菌最佳接種比例為8∶1～14∶1。在此接種比例區(qū)間，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量可達1.7～1.8 g/L。在此后的多次試驗中，此接種范圍內(nèi)獲得的β-胡蘿卜素產(chǎn)量無顯著差異。為了試驗過程中的可操作性，將正負菌接種比例固定為10∶1。

圖2　正負菌不同接種量下β-胡蘿卜素的產(chǎn)量Fig.2　The β-carotene production with different inoculation amount of plus(+) to minus(-) spores

2.3三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的初級代謝情況由圖3可知，三孢布拉霉菌株接種后立即進入對數(shù)生長期，48～52 h到達對數(shù)生長末期，培養(yǎng)至52～60 h，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)耗盡，菌體生長進入平臺期。而β-胡蘿卜素的生成遲于生物量的增長，從16 h進入對數(shù)生長期，在生物量進入平臺期后仍持續(xù)增長。隨著發(fā)酵的進行，生物量和β-胡蘿卜素不斷增加，發(fā)酵液中的糖源不斷消耗，殘?zhí)遣粩鄿p少，由于發(fā)酵液中糖濃度的降低使得糖的消耗趨緩，在52～60 h需要進行一次補液。

圖3　三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的初級代謝情況Fig.3　Primary metabolism of fermentative production ofβ-carotene by Blakeslea trispora

2.4發(fā)酵溫度對代謝的影響為了進一步確認最佳補液時間，同時考察溫度的影響，選取菌體生長進入平臺期的時間節(jié)點52和60 h，考察不同發(fā)酵溫度對菌體生長的影響。由圖4可知，60 h的生物量均稍高于52 h的生物量，60 h的β-胡蘿卜素產(chǎn)量也稍高于52 h，說明在52～60 h菌體仍緩慢生長。因此，應(yīng)選擇對數(shù)生長末期，即52 h進行接種較理想。52 和60 h的生物量與β-胡蘿卜素隨溫度的變化曲線呈高度的相似性，同時在24和27 ℃出現(xiàn)2個峰值，因此，在這2個溫度點分別接種至發(fā)酵液培養(yǎng)基，繼續(xù)進行生長曲線的跟蹤監(jiān)測。

圖4　生物量與β-胡蘿卜素產(chǎn)量隨溫度的變化Fig.4　The change of biomass and β-carotene production with temperature

圖5　不同溫度下的生物量Fig.5　Biomass under different temperature

由圖5可知，72 h前24 ℃的生物量高于27 ℃的生物量，而在72 h后，27 ℃的生物量高于24 ℃的生物量，并在發(fā)酵終點96 h重新吻合。其原因可能在于三孢布拉霉菌的發(fā)酵是由正菌和負菌共同完成，其正菌和負菌的生長條件和生長速度存在一定差異，導(dǎo)致在整體生長情況下呈現(xiàn)2個交替上升的較優(yōu)發(fā)酵生長溫度。其機理有待今后進一步探究。根據(jù)在接近發(fā)酵終點92 h測定的生物量可以看出，27 ℃的發(fā)酵生長情況優(yōu)于24 ℃，因此，確定27 ℃為最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.5接種量對代謝的影響種子培養(yǎng)結(jié)束后，分別考察將種子液以不同接種比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行全流程培養(yǎng)的發(fā)酵結(jié)果。由圖6可知，接種量為1%～8%，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量和接種量成正比例提高，接種量達10%時略有下降。

圖6　接種量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.6　The influence of the inoculation amount on the β-carotene production

由圖7可知，盡管在對數(shù)生長階段，即30 h左右，殘?zhí)怯捎谙难杆俣a(chǎn)生波動，但在對數(shù)生長末期即52 h左右時，殘?zhí)菨舛劝凑?%～8%的接種比例依次遞減，與β-胡蘿卜素的產(chǎn)量呈較好的相關(guān)性，說明接種比例從1%逐步增加到8%的過程中，菌體生長越來越旺盛，糖的消耗越來越多，目標產(chǎn)物β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也逐步提高。因此，將8%(V/V)的接種比例確定為最佳接種比例。

圖7　不同接種量的糖代謝情況Fig.7　The carbohydrate metabolism with different inoculation amount

3　結(jié)論

該研究利用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素，研究了菌體相關(guān)生長代謝曲線，并在此基礎(chǔ)上對發(fā)酵條件進行了一定優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳正負菌孢子接種比例為正菌∶負菌=10∶1；最佳補液時間為52 h，最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃，最佳種子液接種比例為8%。

在進行一系列的培養(yǎng)條件優(yōu)化后，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量從1.45 g/L提高到2.26 g/L，產(chǎn)量提高了55.9%，取得了較好的效果，為β-胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 曾強松,童海寶,徐靜安,等.三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素工藝研究[J].工業(yè)微生物,2002,32(4): 7-10.

[2] 廖春麗,郭瑞強,陳蘭英,等.β-胡蘿卜素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,29(1): 60-64.

[3] 潘鵬,楊斯,蔡俊,等.三孢布拉霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(4): 36-40.

[4] 尹金鳳,王志軒,吳欣森,等.三孢布拉氏霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究進展[J].食品科學(xué),2014(13):316-325.

[5] 王海濱.類胡蘿卜素的紫外可見光譜特性及其應(yīng)用[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2004,23(4):11-13.

[6] KIM S W,SEO W T，PARK Y H．Enhanced synthesis of trisporic acid and β-carotene production inBlakesleatrisporaby addition of non-ionic surfactant,Span 20[J].Journal of fermentation and bioengineering,1997,84: 330-332.

[7] 張陽.三孢布拉霉大量產(chǎn)孢條件及發(fā)酵動力學(xué)研究[D].武漢: 華中科技大學(xué),2013: 13-25.

Metabolic Control of Fermentative Production of β-carotene byBlakesleatrispora

YU Jing-lan,SUN Jian-chun,YANG Ye

(Shanghai Research Institution of Chemical Industry,Shanghai 200062)

[Objective] The aim was to study the metabolic control of fermentative production of β-carotene byBlakesleatrispora,which provide a basis for increasing the production of β-carotene by optimized conditions.[Method] Through determiningβ-carotene content by ultraviolet spectrophotometer,the inoculation ratio of plus(+) and minus(-) spores were optimized.Through study on the metabolic control of efficient synthesis of β-carotene by matedBlakesleatrispora,the optimal medium supply time,culture temperature and inoculation amount was determined.[Result] After above,the optimum conditions were obtained,with the inoculation ratio of plus(+) and minus(-) spores was 10∶1,the time of medium supply was 52 hours,the culture temperature was 27 ℃,the inoculation amount was 8%.[Conclusion] Through study on the metabolic control of fermentation production of β-carotene byBlakesleatrispora, the optimum conditions were obtained.As a result,the production of β-carotene was increased from 1.45 to 2.26 g/L,the rate of increase was up to 55.9%,which lays a foundation for the industrial production of β-carotene.

Blakesleatrispora; β-carotene; Fermentation; Metabolic control

上?；ぱ芯吭嚎蒲杏媱濏椖?1806A-1)。

喻靜蘭(1981- )，女，湖北武漢人，工程師，碩士,從事功能食品微生物發(fā)酵工程研究。

2016-06-30

TS 201.3

A

0517-6611(2016)24-085-03